2024-03-28T21:25:19Zhttps://www.tdx.cat/oai/requestoai:www.tdx.cat:10803/4165972018-09-29T02:00:13Zcom_10803_339col_10803_356
nam a 5i 4500
Quitina
Quitosano
Ingeniería Enzimática
Desacetilasas de quitina
Glicosintasas
Evolución dirigida
High Throughput Screening
B-glucanos
Biología Molecular
Ingeniería enzimática de quitina desacetilasas y glicosintasas como biocatalizadores: diseño racional de la especificidad y evolución dirigida
[Barcelona] :
Universitat Ramon Llull,
2017
Accés lliure
http://hdl.handle.net/10803/416597
cr |||||||||||
AAMMDDs2017 sp ||||fsm||||0|| 0 spa|c
Aragunde Pazos, Hugo,
autor
1 recurs en línia (349 pàgines)
Tesi
Doctorat
Universitat Ramon Llull. IQS SE - Bioenginyeria
2017
Universitat Ramon Llull. IQS SE - Bioenginyeria
Tesis i dissertacions electròniques
Planas, Antoni
(Planas Sauter)
supervisor acadèmic
TDX
Els resultats presentats en aquesta tesi estan dividits en dos capítols en funció dels enzims estudiats: quitina desacetilases i glicosintases.
Les de-N-acetilases de quitina (CDAs) són un grup d'enzims que catalitzen la hidròlisi dels grups acetamido dels residus GlcNAc de quitina, quitosà i oligosacàrids de quitina (COS). Les CDAs pertanyen a la família 4 de les esterases de carbohidrats (CE4), la qual també inclou esterases de acetilxilà i desacetilases de petidoglucà.
Els quitosans són una família de polisacàrids de N-acetil-glucosamina i glucosamina. Els COS i derivats parcialment desacetilats (paCOS) han demostrat ser molècules bioactives en un ampli rang d'aplicacions com poden ser antimicrobians, immunoestimulants, nano formulacions per drug o gene delivery, promotors de creixement vegetal, promotors de la cicatrització de ferides, etc. La majoria de les activitats biològiques associades als paCOS semblan dependre no només del grau de polimerització (DP) i de acetilació (DA), sinó també del patró de acetilació (PA). Aquesta relació estructura funció remarca el paper crucial de les CDAs.
Els objectius d'aquesta tesi comprenen els estudis de la relació estructura funció dins el marc del Subsite capping Model. La presència de diversos loops envoltant el centre actiu, els quals varien en mida i estructura en funció de la CDA, defineixen els subllocs accessibles en el solc catalític i, a la vegada, també són responsables de definir el patró de desacetilació. En aquesta tesi es reporta la validació d'una metodologia analítica HPLC-MS per a la monitorització de l'activitat de las CDAs, la demostració experimental del Subsite Capping Model usant la desacetilasa de quitooligosacàrids de Vibrio cholerae i els resultats del disseny racional dels loops per a la modulació de l'especificitat de substrat. Diverses generacions de mutants van ser estudiades obtenint com a resultat un enzim altament optimitzat.
L'altre capítol inclou el treball realitzat en el camp de les glicosintases. Aquests enzims s'han convertit en unes eficients eines per a la síntesi d'oligosacàrids, glicoconjugats i polisacàrids. Es deriven de glicosidases amb retenció de conformació anomérica en què l'activitat hidrolítica ha estat abolida per la mutació del nucleòfil catalític però que catalitzen eficientment reaccions de transglicosilació quan es proporcionen donadors activats amb fluorur amb la configuració anomérica oposada a la del substrat del enzim hidrolític parental. Millorar el rendiment de les glicosintases actuals (i futures) i l'enginyeria de l'especificitat per substrats artificials estan sent afrontades per metodologies d'evolució dirigida. Aquestes aproximacions depenen en gran mesura en mètodes d'alta eficiència de cribratge.
En aquest treball es presenta un mètode de cribratge independent de l'especificitat del enzim per al cribratge de biblioteques de glicosintases basat en un sensor químic fluorescent de fluorur capaç de traduir l'activitat glicosintasa a fluorescència. Es descriu el desenvolupament i validació de l'assaig així com la seva aplicació a una biblioteca de saturació del residu nucleòfil a la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis. A més, es troba un nou i sorprenent mutant que és posteriorment caracteritzat, el mutant E134D. Aquesta nova glicosintasa proporciona coneixement sobre el papel dels residus adjacents en la reacció catalítica de les glicosintases.
u71
ES-BaCBU
cat
rda
ES-BaCBU
text
txt
rdacontent
informàtic
c
rdamedia
recurs en línia
cr
rdacarrier