2024-03-29T06:46:21Zhttps://www.tdx.cat/oai/requestoai:www.tdx.cat:10803/3083242017-09-01T15:49:07Zcom_10803_120col_10803_162
nam a 5i 4500
HEK293
Biofàrmacs
Biofármacos
Biopharmaceuticals
Metabolisme
Metabolismo
Metabolism
Study and characterisation of human HEK293 cell line as a platform for recombinant protein production
[Barcelona] :
Universitat Autònoma de Barcelona,
2015
Accés lliure
http://hdl.handle.net/10803/308324
cr |||||||||||
AAMMDDs2015 sp ||||fsm||||0|| 0 eng|c
9788449055416
Liste Calleja, Leticia,
autor
1 recurs en línia (319 pàgines)
Tesi
Doctorat
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química
2015
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química
Tesis i dissertacions electròniques
Cairó i Badillo, Jordi Joan,
supervisor acadèmic
Lecina i Veciana, Martí,
supervisor acadèmic
TDX
El
present
treball
es
centra
en
l’estudi
de
la
producció
de
proteïnes
recombinants
en
línies
cel·∙lulars
de
mamífer.
Concretament,
s’ha
realitzat
l’estudi
de
tres
estratègies
de
bioprocés,
totes
elles
basades
en
el
cultiu
de
cèl·∙lules
HEK293.
Com
a
proteïna
model
per
a
l’expressió
de
proteïnes
heteròlogues
s’ha
triat
la
proteïna
CapPCV2,
la
qual
conforma
la
càpsida
viral
del
Circovirus
porcí
serotip
2
(PCV2).
Aquest
virus
és
l’agent
causal
de
PCVDS
(porcine
circovirus
diseases
o
malaties
derivades
de
circovirus
porcí).
Aquest
terme
engloba
un
conjunt
de
malalties
i
síndromes
que
tenen
un
elevat
impacte
econòmic
en
la
indústria
porcina.
El
projecte
s’ha
enfocat
des
de
la
perspectiva
de
desenvolupament
i
optimització
del
bioprocés
i,
en
conseqüència,
l’increment
de
la
producció
volumètrica
ha
estat
la
força
impulsora
de
tot
el
treball.
En
primer
lloc
es
presenten
els
estudis
per
a
la
selecció
del
medi
de
cultiu
i
suplements
nutricionals.
El
creixement
cel·∙lular
depèn
en
gran
mesura
de
les
característiques
nutricionals
i
fisicoquímiques
del
medi
en
que
se
les
cultiva.
Per
tant,
trobar
el
medi
adequat
és
un
dels
factors
clau
per
a
l’expansió
del
cultiu
cel·∙lular.
L’estudi
inicial
de
medis
de
cultiu
va
permetre
augmentar
sis
vegades
la
densitat
de
cèl·∙lules
viables
en
comparació
al
medi
original
en
que
es
cultivaven.
D’altra
banda,
s’han
explorat
diferents
estratègies
de
cultiu,
i
com
a
resultat
s’ha
implementat
una
estratègia
de
fed-‐batch
que
ha
permès
arribar
a
densitats
cel·∙lulars
de
26.8x106
cell/mL.
En
el
segon
i
tercer
capítol
de
resultats,
s’avaluen
tres
estratègies
diferents
per
a
la
producció
de
la
proteïna
recombinant
CapPCV2
(r-‐CapPCV2).
La
primera
estratègia
ha
estat
la
infecció
de
cèl·∙lules
HEK293
amb
un
vector
adenoviral
que
codifica
el
gen
de
la
CapPCV2
(vector
generat
dins
del
treball
d’aquesta
tesis
doctoral).
Els
paràmetres
d’infecció
s’han
estudiat
en
profunditat
per
tal
de
trobar
els
paràmetres
d’infecció
(medi
de
cultiu,
MOI
(multiplicitat
d’infecció),
TOI
(temps
d’infecció)
i
TOH
(temps
de
recollida))
per
a
la
millora
de
la
producció
de
la
proteïna
i
el
vector
adenoviral.
La
segona
i
tercera
estratègia
estan
basades
en
la
generació
de
línies
cel·∙lulars
estables.
Concretament,
s’ha
generat
una
línia
cel·∙lular
productora
de
r-‐CapPCV2
a
partir
de
la
integració
a
l’atzar
del
vector
plasmídic
en
el
genoma
de
la
cèl·∙lula.
D’altra
banda,
s’han
generat
línies
cel·∙lulars
amb
la
integració
dirigida
del
gen
en
llocs
prèviament
caracteritzats
com
d’altra
transcripció
genètica.
La
integració
dirigida
s’ha efectuat
mitjançant
la
tecnologia
RMCE
(recombinant
mediated
cassette
exchange,
o
bescanvi
de
casset
mitjançada
per
recombinació).
Després
de
la
comparació
de
les
productivitats
específiques
i
volumètriques
aconseguides
amb
cada
estratègia,
el
millor
productor
va
ser
seleccionat.
Nogensmenys,
r-‐CapPCV2
es
produeix
en
quantitats
molt
baixes
i
per
tant
no
ha
sigut
possible
dissenyar
un
procés
de
producció
rentable
i
altres
alternatives
de
producció
s’haurien
d’estudiar
en
un
futur.
Finalment,
l’estudi
d’un
comportament
metabòlic
particular
observat
en
les
cèl.lules
en
cultiu
s’ha
adreçat
des
d’una
perspectiva
fisiològica
i
metabòlica.
A
certes
condicions
extracel·∙lulars,
s’ha
observat
que
les
cèl·∙lules
HEK293
poden
consumir
de
manera
simultània
glucosa
i
lactat
durant
el
seu
creixement
exponencial.
Després
d’un
ampli
estudi
d’aquestes
condicions,
s’ha
determinat
que
el
canvi
de
la
producció
d’àcid
làctic
(que
és
el
principal
problema
dels
cultius
d’alta
densitat
de
cèl·∙lules
de
mamífer)
cap
al
consum
d’aquest
metabòlit
pot
ser
generat
des
de
el
començament
del
cultiu
quan
el
pH
és
de
6.6
i
la
concentració
de
lactat
és
de
4-‐8mM.
En
aquestes
condicions,
ni
el
creixement
cel·∙lular
ni
la
producció
de
proteïna
es
veuen
afectades
negativament.
A
la
llum
d’aquests
resultats,
es
genera
la
hipòtesi
de
que
les
cèl·∙lules
HEK293
poden
co-‐transportar
el
lactat
extracel.lular
i
els
protons
com
un
mecanisme
de
detoxificació
del
pH.
D’altra
banda,
l’aplicació
de
l’anàlisi
de
balanç
de
fluxos
(FBA)
ha
revelat
que
quan
la
glucosa
i
el
lactat
es
consumeixen
simultàniament
s’aconsegueix
un
metabolisme
“equilibrat”,
és
a
dir
els
fluxos
de
la
glicòlisi
i
el
cicle
TCA
esdevenen
similars,
evitant
l’acumulació
de
piruvat
en
el
citosol,
la
seva
transformació
a
làctic
i
finalment
la
secreció
d’aquest
metabòlit.
Aquest
comportament
és
totalment
oposat
al
que
s’observa
de
forma
general
en
els
cultius
de
cèl.lules
de
mamífer
en
creixement
exponencial,
on
els
elevats
fluxos
de
la
glicòlisi
troben
una
limitació
en
els
fluxos
d’entrada
a
la
mitocòndria
(és
a
dir,
del
cicle
TCA)
i
conseqüentment
el
lactat
és
produït
i
secretat
al
medi.
La
construcció
d’un
model
metabòlic
i
l’aplicació
de
FBA
permetrà
fer
prediccions
in
silico
de
comportaments
metabòlics
causats
per
la
sobreexpressió
o
el
silenciament
de
gens
diana.
Aquesta
estratègia
obre
la
possibilitat
de
generar
línies
cel·∙lulars
que
presentin
un
metabolisme
optimitzat
per
tal
d’estudiar
estratègies
de
cultiu
més
eficients
per
a
l’increment
de
la
densitat
cel·∙lular
i
productivitat
de
proteïna
recombinant.
a
ES-BaCBU
cat
rda
ES-BaCBU
text
txt
rdacontent
informàtic
c
rdamedia
recurs en línia
cr
rdacarrier