2024-03-29T13:01:45Zhttps://www.tdx.cat/oai/requestoai:www.tdx.cat:10803/1232982017-09-01T15:37:58Zcom_10803_120col_10803_162
nam a 5i 4500
PMSG
Pichia Pastoris
Bioprocess
Development of the production process for a recombinant hormone and evaluation of its biological activity
[Barcelona] :
Universitat Autònoma de Barcelona,
2013
Accés lliure
http://hdl.handle.net/10803/123298
cr |||||||||||
AAMMDDs2013 sp ||||fsm||||0|| 0 eng|c
Font Ingles, Albert,
autor
1 recurs en línia (202 pàgines)
Tesi
Doctorat
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química
2012
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química
Tesis i dissertacions electròniques
Valero Barranco, Francisco,
supervisor acadèmic
Resina Rodríguez, David,
supervisor acadèmic
TDX
Durant el curs d’aquest treball, es va dur a terme l’expressió de l’hormona Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG), també coneguda com equine Chorionic Gonadotropin (eCG) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris. La PMSG consta de dues subunitats que varen ser expressades sota control del promotor AOX1. També es va desenvolupar l’upstream i el downstream del procés de producció per la PMSG recombinant (rPMSG).
En primer lloc es va desenvolupar un assaig in vitro amb cèl·lules de Leydig (MLTC-1) per tal de validar que la conformació de l’hormona recombinant fos la correcta.
En segon lloc, es van construir dos vectors d’expressió amb la Human Serum Albumin (HSA) fusionada a l’extrem C-terminal i N-terminal de la subunitat beta de la PMSG. A més, aquests vectors també contenien una còpia del gen de la subunitat alfa sota el control d’un promotor AOX1 independent. Els 12 punts d’O-glicosilació presents en la regió del C-terminal peptide (CTP) de la subunitat beta van ser eliminats amb l’objectiu de reduir la capacitat immunogènica que tenen els glicans de les proteïnes expressades en llevat. Eliminant tots els punts d’O-glicosilació la proteïna hagués vist reduït dràsticament el seu temps de vida mitja en sang, per aquesta raó es va decidir fusionar-la a la HSA amb l’objectiu de restablir aquesta mancança. Els primers cultius a petita escala van deixar entreveure que la fusió gènica de la HSA a l’extrem N-terminal de la subunitat beta presentava clars indicis de degradació per part de proteasas i per tant, aquest constructe va ser descartat. Per una altra banda, el constructe amb la HSA fusionada geneticament al C-terminal de la subunitat beta també presentava proteòlisi, però en aquest cas la degradació era parcial i una part de la proteïna es mantenia intacte.
Amb la finalitat de trobar les condicions de procés més adequades per tal reduir aquesta degradació parcial de la proteïna es varen realitzar una sèrie de cultius en batch comparant temperatures i pH diferents, determinant a la fi que a pH 6,5 i 22ºC la degradació intracel·lular de la proteïna recombinant es veia clarament reduïda. Ambdós paràmetres es van implementar en un cultiu en fed-batch millorant significativament la quantitat de proteïna no degradada tal com mostren els assajos in vitro. Malauradament, experiments de viabilitat cel·lular duts a terme amb citometria de flux i els anàlisi de les fraccions citosòliques de les cèl·lules deixaven entreveure que la degradació de la proteïna es donava durant la seva via de secreció i que per tant l’eliminació de la proteòlisi mitjançant la implementació d’alternatives en les condicions de procés no era possible.
Diferents assajos d’eficàcia de la hormona recombinant es varen dur a terme amb rates immadures demostrant la manca d’activitat LH i FSH de l’hormona recombinant. Sabent que una de les possibles causes per aquesta manca d’activitat podria ser la curta vida mitja de la proteïna en sang, es va dur a terme un estudi farmacocinètic en conills que donava suport a aquest extrem.
a
ES-BaCBU
cat
rda
ES-BaCBU
text
txt
rdacontent
informàtic
c
rdamedia
recurs en línia
cr
rdacarrier