Un modelo en Drosophila del mecanismo de patogénesis de las expansiones ctg en la distrofia miotónica.

Author

Monferrer Sales, Lidón

Director

Artero Allepuz, Rubén D.

Date of defense

2007-06-08

ISBN

9788437069333

Legal Deposit

V-3566-2008



Department/Institute

Universitat de València. Departament de Genètica

Abstract

La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad neuromuscular que se debe a<br/>una expansión de repeticiones CTG inestables en la región 3' no traducida del gen<br/>proteína kinasa de la DM (DMPK). La DM1 se caracteriza por la miotonía y distrofia<br/>muscular que muestran los pacientes, los cuales también presentan cataratas,<br/>arritmias cardiacas y alteraciones neuropatológicas. A nivel bioquímico muestran<br/>defectos en el procesado alternativo de pre-mRNAs específicos lo cual explica algunos<br/>síntomas definitorios de la DM1. El mecanismo de patogénesis se debe a la toxicidad<br/>de los RNAs con expansiones CUG para la célula. Varias proteínas de unión a RNA,<br/>como las proteínas humanas Muscleblind-like MBNL1-3 son secuestradas por los<br/>transcritos mutantes DMPK. Las proteínas MBNL colocalizan con los foci ribonucleares<br/>CUG dentro de los núcleos de músculo y neuronas de pacientes DM1. Existen<br/>defectos asociados a DM1 en ratones knockout para Mbnl1 y en moscas mutantes<br/>muscleblind. Nos propusimos generar un modelo en Drosophila de la DM1 para<br/>entender su mecanismo molecular y celular. En primer lugar comprobamos que las<br/>proteínas Muscleblind de Drosophila y la humana MBNL1 eran homólogos funcionales.<br/>Un modelo basado en secuestrar la proteína Muscleblind endógena con RNAs<br/>portadores de repeticiones CUG sólo sería relevante desde el punto de vista<br/>biomédico si la proteína de Drosophila y la humana realizan funciones equivalentes.<br/>Una vez demostrada la conservación funcional entre ambas proteínas mediante el<br/>rescate del fenotipo mutante muscleblind expresando la proteína humana, generamos<br/>moscas transgénicas capaces de expresar 60 y 480 repeticiones CUG en un transcrito<br/>no codificante bajo el control del sistema GAL4/UAS. Detectamos que los RNAs de<br/>480 repeticiones CUG formaban inclusiones nucleares y que Muscleblind era<br/>secuestrada por estos transcritos tal y como ocurre en pacientes DM1. La expresión<br/>de RNAs (CUG)480 en músculo mostró una reducción dependiente de la edad en el<br/>tamaño de la fibra de los músculos indirectos del vuelo y un aumento en el número de<br/>vacuolas. Analizamos el patrón de procesado de la &#945;-actinina, un gen muscular, en<br/>moscas que expresan RNAs (CUG)480 y se observó una alteración en los niveles de<br/>isoformas. En pacientes también se ha descrito una degeneración en las células de la<br/>retina y una pérdida en las neuronas fotorreceptoras. Analizamos la retina de las<br/>moscas modelo que expresaban RNAs (CUG)480 en el disco de ojo-antena y mostraron<br/>alteraciones en la adhesión de las células subretinales y la falta de los rabdómeros de<br/>los fotorreceptores. Externamente mostraban un fenotipo de ojo rugoso y ligeramente<br/>más pequeño que utilizamos para comprobar mediante una combinación alélica de<br/>pérdida de función de muscleblind que las repeticiones CUG estaban interfiriendo<br/>genéticamente con la función de este gen. Realizamos una búsqueda de<br/>modificadores dominantes con este fenotipo ojo rugoso para identificar genes<br/>potencialmente relacionados con el mecanismo de patogénesis de la enfermedad.<br/>Identificamos los genes viking y thread entre otros como modificadores y los<br/>agrupamos en cinco categorías en función del proceso celular en el que estuvieran<br/>actuando; factores de transcripción reguladores, reguladores de la estructura de la<br/>cromatina, adhesión celular, apoptosis y metabolismo del RNA. Finalmente<br/>comprobamos in vivo si los RNAs CUG podían ser una fuente de siRNA o miRNAs. La<br/>expresión de estos RNAs de doble cadena incrementaron los niveles de transcritos de<br/>muscleblind por un mecanismo desconocido. En resumen, hemos demostrado que<br/>estas moscas reproducen aspectos de la enfermedad humana DM1 y pueden<br/>utilizarse para el estudio de la misma.


Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a neuromuscular disease involving the expansion<br/>of unstable CTG repeats in the 3´ untranslated region of the DM protein kinase (DMPK)<br/>gene. DM1 is multisystemic and characteristic features include myotonia, muscular<br/>dystrophy, cardiac arrhythmias, and neuropathology. A biochemical hallmark of DM1 is<br/>misregulated alternative splicing of specific skeletal muscle, heart and brain premRNAs.<br/>In mice, expression of 250 CUG repeats within a heterologous RNA gives rise<br/>to DM1-like phenotypes demonstrating that expanded CUG repeat transcripts are toxic<br/>to cells. RNA binding proteins, most notably human Muscleblind-like proteins MBNL1-3<br/>are sequestered by mutant DMPK transcripts. MBNL proteins co-localize with CUG<br/>ribonuclear foci within muscle and neuron nuclei in DM1 patients. DM1-associated<br/>defects are remarkably similar to those observed in Mbnl1 knockout mice and<br/>muscleblind mutations in Drosophila provide additional examples of DM1-like<br/>alterations. To understand this toxic RNA gain-of-function mechanism we developed a<br/>Drosophila model expressing 60 and 480 CUG repeats in the context of a nontranslatable<br/>RNA. Previously, we showed that MBNL1 rescues a muscleblind loss-offunction<br/>phenotype, thus demonstrating functional conservation. CUG-expressing flies<br/>reproduced aspects of the DM1 pathology, including nuclear accumulation of CUG<br/>transcripts, dystrophic muscles that degenerate with age, splicing misregulation, and<br/>reduced Muscleblind activity (evident from the enhancement of CUG-induced<br/>phenotypes by a decrease in muscleblind dose). Targeted expression of CUG repeats<br/>to the developing eye was toxic originating eyes externally rough and smaller than<br/>normal. This phenotype was utilized to identify 15 genetic modifiers. These included<br/>viking and thread, which suggest cellular processes previously unknown to be altered<br/>by CUG repeat RNA such as cell adhesion, programmed cell death, nuclear-cytoplasm<br/>export complex ECJ, and chromatin remodelling. We also explored the possibility that<br/>CUG repeat RNA could be a source of small interfering RNAs, thus silencing<br/>transcripts containing complementary sequences such as muscleblind transcript<br/>themselves. Surprisingly, we detected an increase of muscleblind mRNA in CUGexpressing<br/>flies. To sum up, here we describe Drosophila flies that reproduce aspects<br/>of the human disease DM1 and that can find application in the study of DM1.

Subjects

575 - General genetics. General cytogenetics

Knowledge Area

Facultat de Biològiques

Documents

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