Introducción de la tecnología de transferencia génica en lubina (Dicentrarchus labrax)

Abstract

Este trabajo abarca distintos aspectos de la metodología de la transferencia<br/>génica en lubina, tanto in vitro como in vivo. Por una parte, se ha centrado en el estudio<br/>y evaluación de la transferencia génica somática como posible sustitución a la<br/>transgénesis estable en distintas aplicaciones. Por otra parte, se ha evaluado el sistema<br/>de regulación por tetraciclina para la regulación exógena de genes en peces. Por último,<br/>se ha probado que una línea celular de lubina puede utilizarse como sistema de<br/>expresión de genes exógenos.<br/>Por primera vez se demuestra que la inyección de DNA plasmídico es eficiente<br/>para transferir genes exógenos a músculo de lubina. Los factores que favorecen la<br/>expresión son, dosis altas de plásmido, el uso de un promotor adecuado, y un estado<br/>metabolicamente activo del músculo. La expresión que se obtiene es transitoria,<br/>alcanzándose el máximo cinco días después de la inyección. Una limitación de esta<br/>técnica es la incapacidad de reproducir en los distintos individuos inyectados, la<br/>manera exacta en que la aguja de inyección entra en el paquete muscular, lo que<br/>origina una gran variabilidad en cuanto a la toma de DNA por parte de las células, y<br/>por tanto en el nivel de expresión del transgen. Esto se puede mejorar aumentando el<br/>número de animales inyectados para disminuir así el error debido a la técnica, o usando<br/>una segunda construcción para normalizar la transfección.<br/>La técnica de inyección de DNA en músculo se ha ensayado como método de<br/>vacunación en peces. Sin embargo, ésta es la primera vez, que se prueba esta técnica en<br/>peces para secretar una hormona en sangre. Como gen a inyectar se ha diseñado y<br/>construido un gen híbrido que codifica una hormona gonadotropa de cadena única de<br/>lubina. Tras su inyección en músculo de lubina se pudo detectar la proteína en plasma.<br/>Para sistemas de origen piscícola, no se dispone hasta el momento de un método<br/>que permita controlar la expresión de genes exógenos de manera fiable. Por primera<br/>vez, hemos probado la utilidad del sistema de regulación por tetraciclina para esta<br/>misión. Tras valorar diferentes versiones del sistema en células de pez in vitro y en<br/>músculo in vivo, podemos concluir que la opción más eficiente es el uso del<br/>transactivador tTA bajo el control de un promotor estable.<br/>Al igual que en células de mamíferos, hemos comprobado que las células de pez<br/>también presentan dificultades para mantener el sistema de regulación por tetraciclina<br/>de una manera funcional; como resultado, encontrar clones con un grado de regulación<br/>óptimo y un nivel bajo de expresión basal es difícil. Sin embargo, el uso de una<br/>estrategia basada en el uso del plásmido nuevo pTet-luc+-pur/GFP facilita esta tarea, y<br/>permite obtener un alto porcentaje de clones regulables.<br/>A lo largo de este trabajo se han comparado los promotores CMV, de origen<br/>viral, y el promotor de la actina ß de carpa, para dirigir la expresión de distintos genes<br/>tanto en las líneas celulares EPC y SBL, como en músculo de lubina in vivo. Los<br/>resultados nos permite concluir que el promotor de la actina ß de carpa, es más débil en<br/>cuanto al nivel de expresión génica que logra promover, y menos estable a la hora de<br/>mantenerse en una línea celular que el promotor CMV.<br/>Por último, los resultados obtenidos con la línea celular SBL permiten señalar a<br/>esta línea como un sistema de lubina apto para la expresión de genes exógenos. Estas<br/>células son capaces de secretar los productos de los genes introducidos, con lo que<br/>podrían ser utilizadas para la producción de proteínas recombinantes.

This work focuses on different aspects of the gene transfer methodology in sea bass.<br/>On one hand, the use of the somatic gene transfer has been evaluated as an alternative to the<br/>use of stable transgenesis in different applications. Somatic gene transfer has been used as<br/>method of delivery of a recombinant single-chain gonadotropin into the blood stream in sea<br/>bass. On the other hand, we have evaluated the use of the tetracycline regulated system to<br/>control exogenous gene expression in fish. The results showed that the best choice was the use<br/>of the rtTA transactivator under the control of a stable promoter. Finally, a sea bass cell line<br/>has proven to be an efficient system for the expression of exogenous gene.