Proteómica de xilanasas de

Abstract

La presente tesis se ha centrado en la identificación, purificación y caracterización bioquímica de las xilanasas Xyn10A, Xyn30D y Xyn11E de Paenibacillus barcinonensis. Conjuntamente se ha realizado la aplicación de estas enzimas en procesos de modificación de fibras papeleras, con el fin de evaluar su potencial uso en la industria del papel. Las xilanasas son enzimas que catalizan la hidrólisis del xilano, uno de los biopolímeros más abundantes que se ubica en la pared celular vegetal. Actualmente, las xilanasas han adquirido un gran interés comercial en procedimientos que degradan la pared vegetal ya que presentan, frente a los catalizadores químicos, las ventajas de ser biocatalizadores altamente selectivos y no contaminantes, características que las convierten en herramientas útiles para el desarrollo de tecnologías limpias. El trabajo de investigación realizado se enmarca dentro de otro proyecto de mayor envergadura enfocado a la búsqueda, identificación y caracterización de nuevas enzimas capaces de mejorar las propiedades de las fibras papeleras y obtener productos de valor añadido a partir de materiales lignocelulósicos. La xilanasa Xyn10A de P. barcinonensis pertenece a la familia 10 de las glicosil hidrolasas, GH10. Presenta máxima actividad sobre xilanos de maderas duras (haya y abedul) y un alto potencial para la producción de oligosacáridos derivados del xilano. La xilanasa Xyn30D fue identificada mediante el análisis del secretoma de P. barcinonensis. Esta enzima es el primer ejemplo de xilanasa modular de la familia GH30 descrito hasta la fecha. Tiene una estructura bimodular, consistente en el módulo catalítico unido a un módulo de unión a carbohidratos de la familia CBM35. La xilanasa Xyn30D, al igual que su módulo catalítico presenta actividad exclusivamente sobre glucuronoxilanos. Adicionalmente, el módulo catalítico de la xilanasa Xyn30D presenta la estructura lateral β9 característica de las xilanasas de la familia GH30 y la deleción de dicha estructura causa la pérdida de la actividad enzimática. Este resultado es la primera evidencia experimental del requerimiento de la estructura lateral β9 para la actividad de las xilanasas de la familia GH30. El módulo de unión a carbohidratos CBM35 de la xilanasa Xyn30D puede comportarse como una unidad funcional independiente y es capaz de unir las fracciones soluble e insoluble del glucuronoxilano, además de ácido glucurónico. Esta última unión es dependiente de calcio. La xilanasa Xyn11E es una xilanasa homóloga a las del subgrupo de xilanasas de punto isoeléctrico alcalino y bajo peso molecular de la familia GH11, y presenta máxima actividad sobre glucuronoxilanos. La xilanasa Xyn11E requiere de la coexpresión de la chaperona LppX para ser expresada heterólogamente en forma activa y soluble. La aplicación de xilanasas de P. barcinonensis en el blanqueo de pastas papeleras de sisal, especialmente de la xilanasa Xyn10A, permite obtener mejoras importantes tanto en el grado de deslignificación como en la disminución del contenido en ácidos hexenurónicos de las pastas. Existe una correlación positiva entre la capacidad de las xilanasas de liberar azúcares reductores de las pastas papeleras, durante la etapa enzimática previa a la secuencia de blanqueo, y la efectividad de las enzimas en disminuir el contenido en lignina y ácidos hexenurónicos. La aplicación del sobrenadantes crudos de P. barcinonensis como agente blanqueador de pastas de papel puede ser una alternativa de bajo coste para este proceso. Nuestros resultados sugieren que es muy difícil generalizar sobre la efectividad de una familia particular de glicosil hidrolasas para una determinada aplicación industrial, por lo que la idoneidad de una enzima para un proceso debe ser evaluada de forma individual. La utilización de cócteles enzimáticos que contengan varias enzimas puede ser conveniente en determinados procesos industriales para aumentar la eficiencia de los tratamientos.

This thesis has focused on the identification and characterization of xylanases from Paenibacillus barcinonensis with industrial applications. Xylanases are enzymes which catalyze the hydrolysis of xylan, one of the most abundant biopolymer in nature which is located in the plant cell wall. Currently, xylanases have acquired a strong commercial interest in procedures that degrade the plant cell wall, since they have, compared to chemical catalysts, the advantages of being highly selective biocatalysts and nonpolluting, characteristics that make them useful tools for developing of clean technologies. The research work is part of another bigger project focused on the search, identification and characterization of novel enzymes capable of improving the properties of papermaking fibers and get value added products from lignocellulosic materials. The research has focused on the identification of three xylanases Xyn10A, Xyn11E and Xyn30D from the family GH10, GH11 and GH30 respectively. They all have been cloned, heterologously overexpressed in Escherichia coli, purified and biochemically characterized. We had also performed the application of these enzymes in processes of papermaking fibers modification, in order to evaluate its potential use in the paper industry. Our results suggest that it is very difficult to generalize about the effectiveness of a particular family of glycosyl hydrolases for a particular industrial application, so that the suitability of an enzyme to a process must be evaluated individually. The use of enzyme cocktails containing multiple enzymes may be advantageous in certain industrial processes to increase the efficiency of the treatments.