The apoptotic function of Apoptosis-inducing factor (AIF) is well documented in the
literature, but its physiological role in the mitochondrion is less certain. Using a small
interfering RNA (siRNA) strategy, we studied whether modulation of AIF expression in
cultured cells influenced the production of reactive oxygen species (ROS). We found
that siAIF-transfected cells had reduced AIF protein levels and this was paralleled by a
significant increase in ROS. We tested the generality of this response by using two
different human cell lines, the hepatoma cell line Hep3B and cervix carcinoma line
HeLa, and also by employing a mouse ES AIF-KO cell line. The increased ROS were
mitochondrial in origin as a similar silencing strategy in cells devoid of a functioning
mitochondrial electron transport chain (ETC) did not result in a ROS-increase. The
augmented ROS levels were sufficient to activate Hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α),
a ROS-sensitive transcription factor, and this effect could be reversed using
antioxidants, both the broad-range general antioxidant (N-acetyl cysteine) and a
specific mitochondrial-targeted antioxidant (MitoQ), proving the implication of ROS in
the HIF-1α stabilization. We also studied another two redox-sensitive transcription
factor and thus observed up-regulation in the expression of Nuclear factor (erythroidderived
2)-like 2 (Nrf2), however without major changes in Nuclear factor-kappa B
(NF-κB) levels. Examination of the cellular oxygen consumption rate revealed that AIFdepleted
cells had a major impairment of respiration, at Complex I in the ETC. Western
blot analysis also showed a loss of Complex I 39 and 20 kDa subunits. Studies using
the antioxidants mentioned above, revealed that the respiratory competence could be
regained in AIF-silenced cells. However, neither of the antioxidant treatments we used
could recover Complex I assembly. Studies of the energetic state of siAIF cells showed
that despite a 30% decrease in the overall intact cell respiration, these cells maintain
normal basal levels of ATP, presumably due to a higher glycolytic capacity and a lower
proliferation rate. Moreover, we analyzed the expression of another redox-active
protein, thioredoxin, by Western blot and found that the mitochondrial isoform, Trx2,
was significantly decreased when AIF was silenced. Preliminary co-immunoprecipitation
analyses and proteomic studies failed to show any direct correlation between AIF and
Trx2 at the protein level.
Our results lead us to the conclusion that the defect in respiration in siAIF cells is
downstream of Complex I protein loss and is presumably due to ROS-mediated
damage to the ETC. This suggests an integral mitochondrial function of AIF, as a redox
modifier and chaperone-like molecule, necessary for Complex I assembly. Additional
studies are required to define the detailed mechanism of the AIF enzymatic activity in
the mitochondrion and to establish its binding partners.

La función proapoptótica del Factor Inductor de Apoptosis (AIF) está bien
documentada, sin embargo su papel fisiológico en la mitocondria es menos conocido.
Empleando la metodología de interferencia por ARN, estudiamos si la modulación de la
expresión proteica de AIF en cultivo celular modifica la producción celular de especies
reactivas de oxígeno (ROS). Observamos que el silenciamiento de AIF estaba seguido
por un incremento significativo en los niveles de las ROS. Estas ROS fueron
mitocondriales de origen, puesto que el silenciamiento de AIF en células que carecen
de la cadena de transporte electrónico funcional (ETC) en la mitocondria no llevó a un
incremento de ROS. Este incremento fue suficiente para activar el Factor inducible por
hipoxia (HIF-1α), efecto que se puede revertir usando los antioxidantes, N-Acetil
Cisteina y MitoQ, demostrando así la implicación de los ROS en la estabilización de
HIF1-α. Los análisis del consumo de oxigeno celular mostraron que las células de AIF
silenciado sufren una disminución en la respiración celular, al nivel del Complejo I de la
ETC, acompañada por una disminución significativa en la expresión de sus subunidades
39 y la 20kDa. Tratamientos con los antioxidantes previamente nombrados mostraron
que la tasa de respiración se puede recuperar, no siendo así con la expresión del
Complejo I de la ETC. Estudios del estado energético de las células siAIF mostraron
que a pesar de la disminución de 30% en la tasa de la respiración celular, estas células
mantienen niveles normales de ATP, como resultado de un incremento en la capacidad
glucolítica y una reducción en la tasa de proliferación. Posteriormente, analizamos la
expresión de la proteína tioredoxina y observamos una disminución significativa en la
isoforma mitocondrial, la tioredoxina 2 (Trx2), aunque los análisis preliminares de coinmunoprecipitación
y proteómica no mostraron la existencia de una correlación
directa entre las proteínas AIF y Trx2.
Concluyendo, nuestros resultados sugieren que el defecto de la respiración celular es
posterior al defecto en el Complejo I, probablemente como consecuencia al daño de la
ETC por ROS. Esta observación apunta a un papel integrador de AIF en la mitocondria,
como modulador del estatus redox y necesario para el ensamblaje del Complejo I.