Assessment of prepubertal sheep oocyte competence for in vitro embryo production by the Brilliant Cresyl Blue test.

Abstract

La calidad de los oocitos es sinónimo de competencia oocitaria y se define como la capacidad de un oocito para reanudar la meiosis, dividirse después de la fertilización, desarrollarse hasta la etapa de blastocisto, inducir la preñez y conseguir el nacimiento de un animal sano. La selección de los oocitos más competentes es un punto clave en los programas de producción in vitro de embriones (PIVE). El test de Azul de Cresol Brillante (BCB) es un método no invasivo que separa los oocitos que han finalizado su crecimiento (BCB+: citoplasma azul) de los oocitos con la enzima G6PDH activa o oocitos en proceso de crecimiento (BCB-: citoplasma incoloro). En esta tesis, hemos llevado a cabo 3 estudios para probar la capacidad del BCB en seleccionar los oocitos más competentes para la producción in vitro de embriones utilizando corderas como donantes de oocitos. Además se estudiará la competencia oocitaria en relación con el citoplasma y factores moleculares, sus respuestas a las diferentes técnicas de fecundación y nuevos medios de maduración para mejorar la PIVE. En el Experimento 1, se analizaron diferentes concentraciones del BCB (13, 26, 39 y 52 µM) y los oocitos fueron MIV-FIV y CIV. Se evaluó: diámetro de los oocitos, actividad mitocondrial, actividad del factor promotor de la maduración (MPF), la expresión de genes relacionados con el metabolismo (ATP1A1 y COX1) y la función constitutiva de la célula (CPEB y S100A10) y el desarrollo hasta el estadio de blastocisto. Los resultados mostraron que 13 µM de BCB es una concentración adecuada que diferencia los oocitos más grandes (BCB+: 123,66 µm), competentes para desarrollar hasta blastocisto (21%) y con más células (69,71±6,19) que los BCB- (106,82 µm, 9% y 45,91±3,35, respectivamente). La actividad mitocondrial fue mayor en los BCB+ que en los BCB- (3369 y 1565 unidades arbitrarias, respectivamente) y también la actividad de MPF (1,479±0,09 y 1,184±0,05 densidad óptica, respectivamente). La expresión de genes no mostró correlación con la calidad de los oocitos. El objetivo del experimento 2 fue mejorar la producción in vitro de los oocitos BCB- mediante la adición de insulina transferrina selenio y ácido ascórbico durante 12 y 24 h de la MIV. El MPF y el contenido de ATP se midieron antes y después de la MIV. Los resultados no mostraron diferencias en la producción de blastocistos entre los oocitos BCB-. El MPF y el ATP aumentaron en todos los grupos (P <0,001) después de la MIV. En el Experimento 3 se estudiaron técnicas de fecundación como la FIV, ICSI y la activación partenogénetica (AP) en los oocitos BCB+ y BCB-. Se analizó el contenido del ATP intracelular. Los oocitos BCB+ tuvieron un desarrollo hasta blastocito significativamente mayor tras la FIV y la AP (31,7% y 20,5%, respectivamente) que los BCB- (6,7% y 8,8%, respectivamente). Sin embargo los oocitos inyectados (ICSI) no mostraron diferencias en los blastocistos producidos entre los BCB+ y BCB- (14,3% vs 11,8%, respectivamente). Los oocitos BCB+ mostraron tener mayor concentración de ATP que los BCB-. Finalmente podemos concluir que el test del BCB es una metodología fácil, rápida y adecuada para seleccionar los oocitos de corderas más competentes. Los oocitos BCB+ mostraron una mayor producción de blastocistos, actividad mitocondrial y del MPF y mayor contenido de ATP que los BCB-. El test de BCB es un método útil para ser incorporado en los protocolos de PIVE cuando se trabaja con un gran y heterogéneo número de oocitos. Sin embargo este test es menos interesante cuando se trabaja con un pequeño número de oocitos, como en laparoscópica o ICSI.

The oocyte quality is used as synonymous of oocyte competence defined as the ability of an oocyte to resume meiosis, cleave following fertilization, develop to the blastocyst stage, induce a pregnancy and bring the offspring to term in good health. The selection of more competent oocytes is an important point in in vitro embryo production programs. The Brilliant Cresyl Blue (BCB) test has been successfully used as a non invasive methodology to classify oocytes according to their cytoplasm coloration as grown (BCB+: blue cytoplasm) or growing (BCB-: colorless cytoplasm) oocytes. To our knowledge there are no previous reports using this test to select competent oocytes in sheep. We have carried out 3 studies to test the ability of the BCB to select the most competent prepubertal sheep oocytes for in vitro blastocyst embryo production. Furthermore, we pretend to improve the knowledge about oocyte competence related to their cytoplasmic and molecular performances, their responses to different techniques of fertilization and to test new maturation media to improve the blastocyst production. In Experiment 1, different concentrations of the BCB test (13, 26, 39 and 52 µM) were analyzed. After BCB culture all of oocytes were IVM-IVF and IVC. The parameters assessed in this study were: oocyte diameter, mitochondrial activity, maturation-promoting factor (MPF) activity, mRNA relative expression (RE) of genes related to metabolism (ATP1A1 and COX1) and constitutive function of the cell (CPEB and S100A10) and the blastocyst development. The results showed that 13 µM BCB during 60 min could be a suitable concentration to differentiate largest (BCB+, 123.66 µm) and most competent oocytes to develop to the blastocyst stage (21%) and with a higher number of cells (69.71±6.19 S.E.M.) compared with non-stained BCB- oocytes (106.82 µm, 9% and 45.91±3.35 S.E.M., respectively). Mitochondrial activity, assessed by MitoTracker Orange CMTMRos probe, was significantly higher in BCB+ than in BCB- oocytes after in vitro maturation (3369 and 1565 Arbitrary Units, respectively) and the MPF activity, assessed by CDC2 kinase activity assay, showed significantly higher activity at metaphase II stage in BCB+ than in BCB- oocytes (1.479±0.09 and 1.184±0.05 optical density, respectively). The mRNA RE of the different genes analyzed in this work did not show a correlation with the oocyte quality. In Experiment 2, the objective was to improve blastocyst production of small (BCB-) oocytes by addition of Insulin Transferrin Selenium and Ascorbic Acid during 12 and 24 h of IVM. MPF and ATP content were measure before and after IVM. Results showed no differences in blastocyst production between BCB oocytes. The MPF and ATP increased in all groups (P<0.001) after the IVM. In Experiment 3, the aim was to test the blastocyst production after IVF, ICSI and PA of BCB+ and BCB- oocytes. ATP content was analyzed. BCB+ oocytes developed significantly higher up to the blastocyst stage after IVF and PA (31.7% and 20.5%, respectively) than BCB- (6.7% and 8.8%, respectively) oocytes. However, ICSI treated oocytes did not show these differences between BCB+ and BCB- oocytes (14.3% vs 11.8%, respectively). BCB+ oocytes had significantly more ATP content than BCB- oocytes. Finally we can conclude that the BCB test is an easy, fast and suitable methodology to select the more competent sheep oocytes. Good quality oocytes (BCB+) showed higher blastocyst production, mitochondrial and MPF activity and ATP content than BCB- oocytes. The BCB test is a useful method to be incorporated in the embryo production protocol where a large and heterogeneous number of oocytes are use to be in vitro fertilized. However, BCB test is less interesting when working with a small number of oocytes such as in Laparoscopic Ovum Pick Up (LOPU) or ICSI.