Cuantificación en tiempo real de la subunidad hTERT (Telomerase Reverse Transcriptase) del gen de la telomerasa en plasma de pacientes con cáncer colorrectal.

Abstract

INTRODUCCIÓN: Los telómeros son estructuras compuestas por secuencias de DNA repetitivo y de proteínas, ubicadas en los extremos de los cromosomas que intervienen en su funcionamiento y mantienen su estabilidad. El DNA telomérico se acorta con cada división celular. La telomerasa es una enzima con actividad reverso-transcriptasa, que permite elongar el DNA de los telómeros durante la división celular, habiendo correlación entre la expresión del gen que sintetiza la subunidad hTERT y la actividad enzimática. La actividad telomerasa, es prácticamente indetectable en tejidos sanos y se encuentra aumentada en más del 85% de los cánceres (en el cáncer colorrectal, en el 90-100% de los casos).<br/>HIPÓTESIS DE TRABAJO: La determinación de la subunidad hTERT del gen de la telomerasa en plasma de pacientes con cáncer colorrectal, puede utilizarse como marcador tumoral. <br/>OBJETIVOS: Cuantificar en plasma de pacientes con cáncer colorrectal, la subunidad hTERT del gen de la telomerasa, mediante transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa. Analizar el poder de discriminación de este marcador comparándolo con un grupo control. Valorar la correlación de la expresión hTERT con la edad y el sexo, los valores del CEA preoperatorio de los pacientes, el estadio tumoral y el grado de diferenciación tumoral. Determinar la actividad telomerasa en células tumorales, comparándola con células de mucosa sana de colon adyacente al tumor en un subgrupo de pacientes.<br/>MATERIAL Y MÉTODO: Se han incluido 81 pacientes intervenidos de cáncer colorrectal en el Servicio de Cirugía del Hospital Clínico Universitario de Valencia, la mediana de edad fue de 69 años, 51 eran varones. Como grupo control se seleccionaron 50 voluntarios con ausencia de patología neoplásica, la mediana de edad fue de 40 años, 25 eran varones. Se extrajeron 5-8ml de sangre venosa del antebrazo. Se ha cuantificado mediante espectrofotometría el RNA del plasma de la muestra, con transcripción inversa del mismo a DNA y posterior amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa, obteniéndose la expresión del gen hTERT. Se determinó la actividad telomerasa en tejidos en 10 de los pacientes estudiados por método TRAP. En el estudio estadístico, los resultados se abordaron desde un enfoque no paramétrico, utilizándose el test de Spearman como prueba de correlación. Se determinó la sensibilidad y la especificidad del estudio confeccionando la curva ROC.<br/>RESULTADOS: El grupo con CCR ha obtenido un hTERT de 10.94, más elevado que en el grupo control que fue de 0.29 (p<0.001). Con respecto al estadio tumoral, el hTERT ha sido de 5.36, 8.91, 10.24 y 20.18 para los estadios I, II, III y IV respectivamente (p=0.032). 10 pacientes presentaban metástasis hepáticas, estos pacientes han obtenido un hTERT de 20.18, superior al obtenido en el resto de pacientes sin metástasis; 8.64 (p=0.005). El hTERT de los pacientes con adenocarcinomas pobremente diferenciados fue significativamente superior (15.15) con respecto al de los pacientes con AC bien diferenciados (5.65) (p=0.048). La actividad telomerasa ha sido significativamente más elevada en células tumorales de CCR (17.46) que en células de mucosa sana de colon (3.88) (p=0.005). Según la curva ROC confeccionada, hemos obtenido una sensibilidad del hTERT en el estudio del 91.4%, una especificidad del 96%, un valor predictivo positivo del 97.4% y un valor predictivo negativo del 87.3% (área bajo la curva: 0.985). <br/>CONCLUSIONES: La cuantificación en el RNA plasmático de la subunidad hTERT del gen de la telomerasa, ha sido mucho mayor en pacientes con cáncer colorrectal, en comparación con el grupo control, encontrándose significación estadística entre los niveles hTERT y el estadio de la enfermedad. La actividad telomerasa, es más elevada en tejidos tumorales de CCR con respecto a tejidos de mucosa sana de colon de forma significativa.

BLACKGROUND: Telomerase is the enzime responsible for synthesizing DNA from chomosome ends during cellular division. Increased telomerase activity can be found in almost 90% of colorectal tumours.<br/>WORKING HYPOTHESIS: The determination of the subunit hTERT of the gene of telomerase in plasma of patients with colorrectal cancer, can be in use as scoreboard tumour.<br/>OBJECTIVES: To quantify in plasma the hTERT gene in a prospective series of patients operated on for colorectal cancer and to compare these values to a control group. To value the correlation of expression hTERT with the age and the sex, pre-operative CEA levels, stages and differentiation tumour. To determine the telomerase activity in tumour cells, and cells of mucous colon in a subgroup patients. <br/>MATERIALS AND METHODS: Eighty one patients undergoing surgery for colorectal cancer and a control group of fifty healthy volunteers were prospectively studied. Pre-operative venous blood samples were taken from all cancer patients and volunteers. Plasma hTERT expression was determined from peripheal blood based on real-time quantitative for transcription inverse and chain reaction of polimerase (RT-PCR), method normalized to the amount of RNA input using GAPDH gene expression. The telomerase activity was determinated in ten patients by method TRAP.<br/>RESULTS: Median values normalized hTERT (hTERTN) gene expression were higher in colorectal cancer patients (10.94, range 0.93-54.72) than healthy volunteers (0.29, range 0.00-4.63) (P<0.001). No significant differences in hTERTN expression between sex or with age (>0.05). No significant correlation was found between hTERTN expression and CEA values (P=0.218). We found significant differences between hTERTN expression and tumour stage (P=0.104). Median values of activity telomerase were higher in tumour cells of colorectal cancer (17.27, range 4.74-58.71), than cells of mucous colon (3.88, range 1.36-12.56). Sensitivity and specificity of the assay for colorectal cancer detection were 91.4% and 96%, respectively. <br/>CONCLUSIONS: These results show that detection of mRNA based on the qRT-PCR of the telomerase hTERTN gene in plasma clearly differentiates between healthy and colorectal cancer patients and that hTERTN can be detected and quantified in plasma. This opens up a new field as a non-invasive blood test for colorectal cancer diagnosis.