Modificación genética de levaduras vínicas industriales para mejorar la producción de aroma secundario.

Abstract

El aroma es una de las propiedades organolépticas más valorada para determinar la<br/>calidad de un vino. Se caracteriza porque está determinado por cientos de compuestos<br/>volátiles de diversa naturaleza química que se encuentra a concentraciones muy bajas .<br/>En términos enológicos el perfil aromático de un vino se clasifica en tres categorías<br/>denominadas, aroma primario, secundario y terciario. El aroma primario se compone<br/>de sustancias que proceden directamente de la variedad de uva utilizada y de los<br/>compuestos que se generan en el transcurso de la manipulación y acondicionamiento<br/>del mosto. El aroma secundario, es el que se atribuye a los compuestos generados<br/>durante el proceso de fermentación por el metabolismo de las levaduras vínicas. El<br/>aroma terciario, está constituido por sustancias que se sintetizan como consecuencia de<br/>las reacciones enzimáticas y/o físico-químicas en el proceso de envejecimiento del<br/>vino. Pese a esta clasificación, el aroma genérico de fondo, se atribuye<br/>mayoritariamente, a compuestos aromáticos volátiles sintetizados por la levadura<br/>vínica S. cerevisiae a lo largo de la fermentación alcohólica. Los metabolitos secundarios<br/>más relevantes en el aroma genérico de fondo son los ésteres volátiles con fragancias<br/>aromáticas y sus correspondientes precursores alcohólicos cuya producción depende<br/>del balance de actividades alcohol acetiltransferasa y éster hidrolasa. Las alcohol<br/>acetiltransferasas, codificadas por los genes ATF1 y ATF2, catalizan la síntesis de<br/>ésteres volátiles a partir de un alcohol superior y acetil-CoA. La esterasa, codificada<br/>por el gen IAH1, hidroliza los ésteres de acetato rindiendo acetato y el alcohol<br/>constituyente.<br/>Dada la importancia que el metabolismo de la levadura S. cerevisiae ejerce en la<br/>producción de compuestos volátiles responsables del aroma de fermentación,<br/>fundamentalmente ésteres de acetato y alcoholes, en este trabajo se han desarrollado<br/>distintos tipos de estrategias moleculares basadas en técnicas de ingeniería metabólica.<br/>Todas ellas encaminadas a incrementar el aroma secundario originado por la levadura<br/>vínica en forma de ésteres de acetato y alcoholes superiores.<br/>En primer lugar se realizó un estudio de la implicación de las distintas actividades de<br/>síntesis y de degradación que contribuyen en la producción de volátiles. Dicho estudio<br/>se centró en el análisis cuantitativo de la acumulación de ésteres y alcoholes en<br/>distintos tipos de cepas mutantes que carecen de los genes ATF1, ATF2 e IAH1. Los<br/>datos obtenidos muestran que la enzima codificada por el gen ATF1 participa de forma<br/>mayoritaria y por este orden en la síntesis de acetato de isoamilo, acetato de isobutilo,<br/>acetato de 2-feniletilo. Además, indican que la proteína Atf2 también interviene en el<br/>proceso de síntesis, aunque su participación es cuantitativamente menor. Finalmente se<br/>concluye que la proteína Iah1 interviene en la degradación de estos mismos<br/>compuestos.<br/>Posteriormente, las estrategias de ingeniería metabólica desarrolladas fueron las<br/>siguientes:<br/>1.- Sobreproducción de ésteres de acetato por sobreexpresión del gen ATF1<br/>bajo el control del promotor del gen glicolítico TDH3. Con esta estrategia<br/>de consiguió incrementar, del orden de 50 veces, la concentración de ésteres<br/>volátiles en condiciones de vinificación.<br/>2.- Sobreproducción de volátiles por deleción de la éster hidrolasa Iah1. En<br/>este caso se consiguió duplicar la acumulación de dichos compuestos.<br/>3.-Sobreexpresión del gen que codifica la a-cetoisocaproato descarboxilasa<br/>implicada en la conversión del a-cetoisocaproato en alcohol isoamílico. Con<br/>esta estrategia no se consiguió incrementar la cantidad del precursor<br/>alcohólico y/o éster de acetato acumulado.<br/>En conclusión, la estrategia más adecuada para incrementar y/o mejorar el aroma<br/>secundario en el vino es obtener una levadura vínica industrial genéticamente<br/>modificada que contenga una expresión fuerte y constitutiva del gen ATF1.

Flavour is a wine's most important distinguishing characteristic that stem from a<br/>complex, completely non-linear system of interactions among many hundreds of<br/>compounds. Wine flavour is classified according to the sources of the different<br/>compounds contributing to it. This include varietal flavour, flavour compounds<br/>originating from the grapes, fermentative flavour, produced by yeast during alcoholic<br/>fermentation and post-fermentative flavour, compounds that appear during the ageing<br/>process through enzymatic or physicochemical actions. It is well known that during<br/>fermentation processes, yeast cells produce a broad range of aroma-active substances,<br/>which greatly affect the complex flavour of wine. While these secondary metabolites<br/>are often formed only in trace amounts, their concentrations determine the flavour<br/>profile of these beverages. In the main secondary metabolites synthesised for S.<br/>cerevisiae are the volatile esters. Their are the product of an enzyme-catalyzed<br/>condensation reaction between acetyl-CoA and a higher alcohol. Several different<br/>enzymes are involved in formation of esters, which are encoded by genes ATF1 and<br/>ATF2. Furthermore, they can be hydrolyzed by esterase like IAH1 gene product.<br/>Therefore, a balance of these two enzyme activities controls accumulation of volatile<br/>esters.<br/>The aims of this study are to develop several molecular strategies to construct wine<br/>yeast strain that improve accumulation of acetate esters through genetic engineering.<br/>The strategies develops were:<br/>1.- Construct disruptant strain that were lose ATF1, ATF2 and IAH1 gene,<br/>to resolve implication of gene product in volatile production.<br/>2.-Ester overproduction by regulated over expression of ATF1 gene<br/>controlled TDH3 promoter gene and disruption IAH1 gene<br/>3.- Alcohols over production by over expression of THI3 gene.<br/>In conclusion, this study has demonstrated that in the main strategy for improve<br/>fermentative flavour in wine is construct a genetically modified wine yeast which have<br/>heave and constitutive over expression of ATF1 gene