Cambios en la expresión de los genes involucrados en el ciclo celular y apoptosis durante el destete en la glándula mamaria de rata lactante. Papel del GSH.

Abstract

En la glándula mamaria, al final de la lactancia, la acumulación de leche y el descenso de las hormonas lactogénicas inician una cascada de señalización que conduce a la muerte de las células secretoras por apoptosis y a la regresión de tejido mamario. <br/>Esta muerte celular se caracteriza por la liberación de citocromo c al citosol, donde activa las caspasas, responsables de los cambios observados en la apoptosis. Uno de ellos es la fragmentación del ADN internucleosomal, por activación de una endonucleasa. Además también existen cambios a nivel genético: el destete de 2 horas produce una inducción temprana de p53, mientras que otros genes como c-Jun o JNK no aumentan hasta 8 ó 24 horas de destete. La expresión y los niveles de proteína de p21cip1 y p27kip1, ambos inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas, que favorecen la detención del ciclo celular, también está significativamente aumentada tras el destete.<br/>Todos los cambios anteriores se reproducen en la glándula mamaria cuando disminuye la disponibilidad de GSH, bien con propargilglicina (PPG), un inhibidor de la transulfuración hepática con lo que disminuye la síntesis hepática de GSH y con ello su disponibilidad plasmática, o bien con butionina sulfoximina (BSO), inhibidor de la síntesis de GSH. Estos resultados sugieren que el flujo intertisular de GSH es un mecanismo muy importante para abastecer de L-cisteína a la glándula mamaria y resaltan la importancia de este proceso fisiológico en el mantenimiento de la lactancia.<br/>El óxido nítrico (NO) también está implicado en la apoptosis. A altas concentraciones forma derivados más reactivos que pueden inducir la apoptosis por: i) alteración mitocondrial; ii) activación de la vía de las MAP quinasas y iii) daño al ADN y acumulación de p53. En la glándula mamaria de rata lactante se expresan las tres isoformas de la enzima encargada de la síntesis de NO (NOS). No obstante, la expresión de la isoforma endotelial (eNOS) y de la inducible (iNOS) se modifican tras el destete o tras el tratamiento con BSO: los niveles de eNOS disminuyen tras un destete de 24 horas o tras el tratamiento con BSO, mientras que los de iNOS están aumentados con respecto al control y este incremento depende del tiempo de destete. Como consecuencia, la producción de NO en la glándula mamaria está aumentada durante la involución y este aumento induce la apoptosis y genera peroxinitrito, capaz de nitrar residuos de tirosina en las proteínas alterando su función. Podemos concluir que el NO juega un papel importante en la inducción de la apoptosis en la glándula mamaria.<br/>Por último, realizamos un estudio comparativo de los patrones de expresión génica en acini aislados del tejido mamario de ratas lactantes control, sometidas a un destete de 8 horas o tras el tratamiento con PPG mediante Microarray chip. De los, aproximadamente, 9000 genes comparados, sólo encontramos diferencias significativas en un 1-2% y establecimos dos patrones que se reproducían en ambas condiciones: el primero de ellos incluía genes implicados en la apoptosis celular: incrementaba la caspasa-6, la metaloproteinasa MMP-14, JunD o el antígeno CD14. El segundo patrón incluía enzimas implicados en el metabolismo glucídico y lipídico. Durante la lactancia la glándula mamaria es uno de los tejidos más activos en la captación de nutrientes; prácticamente el 50% de la glucosa captada será transformada en lípidos mediante la lipogénesis de novo. Sin embargo, en la involución se inhibe está síntesis de lípidos, por lo que los genes que codifican enzimas de esta vía disminuyen: piruvato deshidrogenasa, piruvato carboxilasa, acetil-CoA carboxilasa, ácido graso sintasa, etc. La disminución de GSH mimetiza los cambios encontrados durante el destete a nivel de la expresión génica.

In the lactating mammary gland, weaning produces mitochondrial cytochrome c release and nuclear DNA fragmentation. This is followed by a significant decrease in milk production and the decline of lactation. Weaning for 2h produces an early induction of p53, whereas c-Jun and JNK are elevated after 24h of weaning. The expression of p21cip1 and p27kip1, both cyclin-dependent kinase inhibitors, is significantly higher in weaned rats when compared to control lactating rats. All the changes mentioned above also happen in the lactating mammary gland when PPG, an inhibitor of the liver trans-sulfuration pathway, is administered. This effect is partially reversed by N-acetylcysteine (NAC) administration. The administration of buthionine sulfoximine (BSO), an irreversible inhibitor of &#61543;-glutamyl cysteine synthetase, to lactating rats produces a decrease in GSH levels and changes in protein levels and gene transcripts similar to the rats with impaired trans-sulfuration pathway. These data suggest that the intertissue flux of glutathione is an important mechanism of L-cysteine delivery to the lactating mammary gland and emphasizes the importance of this physiological event to maintain gene expression required to keep lactation.<br/>Once characterized the apoptosis in the mammary gland we used this model to study "in vivo" the role of nitric oxide during cell death. The three isoforms of the nitric oxide synthase (NOS) are constitutively present in the acini of the lactating mammary gland. The amount of iNOS and NO production are increased during weaning when compared to control lactating glands, but the protein levels of the eNOS isoform are diminished. Western blot analysis demonstrated that protein nitration was increased in the weaned mammary gland, althought limited to a few specific tyrosine-nitrated proteins. A decrease of GSH in the mammary tissue at the peak of lactation partially mimics these findings and emphasizes the role of NO as a potential signal that triggers involution.