Effects of dietary catechins and proanthocyanidins on zinc homeostasis in hepatic cells

Abstract

Les catequines i els seus polímers, les procianidines, són flavonoids presents en hortalisses<br/>i fruits amb efectes beneficiosos sobre la salut. Actuen com a antioxidants segrestant<br/>espècies reactives d'oxigen (ROS) i quelant els metalls ferro i coure. També es comporten<br/>com a molècules senyalitzadores, modulant múltiples vies de senyalització i metabòliques i<br/>l'expressió gènica, incloent-hi la d'enzims antioxidants. Resultats previs del Grup de Recerca<br/>en Nutrigenòmica mostren que una dosi oral aguda d'un extracte de procianidines de llavor<br/>de raïm (GSPE) reprimeix l'expressió de les metal·lotioneïnes (MT), proteïnes lligadores de<br/>zinc, a fetge de rates, i tanmateix incrementa l'expressió del receptor nuclear orfe small<br/>heterodimer partner.(SHP/Nr0b2) (Del Bas et al., 2005). Igualment, es va demonstrar que les<br/>procianidines actuen com a coactivadors transcripcionals del receptor nuclear d'àcids biliars<br/>Farnesoid X Receptor (FXR), el qual es responsable de la sobre-expressió de SHP causada<br/>per GSPE a cèl·lules hepàtiques, i de l'efecte hipotrigliceridèmic de les prociandines effect<br/>(Del Bas et al., 2008; Del Bas et al., 2009).<br/>Els objectius d'aquesta Tesi van ser determinar si les catequines i procianidines<br/>interaccionen amb el zinc, avaluar el seu efecte sobre l'homeòstasi del zinc en cèl·lules<br/>hepàtiques -incloent l'efecte sobre l'expressió de genes MT, utilitzats aquí com a<br/>biomarcadors de l'activitat de les procianidines a cèl·lules hepàtiques-, i disseccionar els<br/>mecanismes pels quals les procianidines afecten l'homeòstasi del zinc, en particular<br/>confirmar si els gens MT són dianes de SHP i FXR.<br/>Els resultats obtinguts mostren que GSPE, així com diverses catequines i procianidines<br/>pures, incloent-hi el flavonoid del te verd (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), lliguen<br/>cations de zinc en solució amb una afinitat més gran que el quelant específic de zinc<br/>Zinquin. En cèl·lules d'hepatocarcinoma humanes HepG2, GSPE inhibeix l'acumulació<br/>intracel·lular de zinc i contraresta els efectes tòxics de dosis elevades de zinc sobre la<br/>viabilitat cel·lular. GSPE reprimeix l'expressió de gens de MTs i d'exportadors de zinc mentre<br/>que estimula l'expressió d'importadors de zinc. L'expressió dels importadors de zinc de la<br/>xarxa Trans-Golgi és estimulada per GSPE. A més a més, GSPE bloqueja la inducció de<br/>l'expressió de MTs per la citoquina proinflamatoria IL-6, pel generador de ROS tBOOH, per<br/>l'agonista de receptors de glucocorticoids dexametasona, i pels metalls coure i zinc.<br/>EGCG reprodueix els efectes de GSPE sobre l'homeòstasi del zinc en HepG2, reprimint<br/>l'expressió de MTs i d'exportadors de zinc, estimulant l'expressió d'importadors de zinc, i<br/>UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI<br/>EFFECTS OF DIETARY CATECHINS AND PROANTHOCYANIDINS ON ZINC HOMEOSTASIS IN HEPATIC CELLS<br/>Isabel Maria Quesada<br/>ISBN:978-84-694-1258-9/DL:T-322-2011<br/>inhibint l'acumulació de zinc intracel·lular i la toxicitat de dosis elevades de zinc. La<br/>procinidina dimèrica B1 i la trimèrica C1 es comporten tenen efectes contraris als de GSPE i<br/>EGCG pel que fa a l'expressió de MT i l'acumulació de zinc total en cèl·lules HepG2.<br/>Pel que fa al zinc làbil citoplasmàtic, la minúscula fracció del total del zinc cel·lular que<br/>modula múltiples vies metabòliques i senyalitzadores, tant GSPE com EGCG i C1 eleven en<br/>gran manera els nivells de zinc làbil detectable per Zinquin a cèl·lules HepG2.<br/>Experiments amb ratolins KO per SHP o per FXR han demonstrat que GSPE reprimeix<br/>l'expressió postprandrial de gens MT a fetge per una via que no depen de SHP però que és<br/>depenent de FXR. A més, l'àcid biliar CDCA, un lligand fisiològic i activador de FXR,<br/>reprimeix l'expressió de gens MT a cèl·lules HepG2. Per tant, els gens MT són diana de FXR<br/>i, conseqüentment, FXR apareix com un receptor nuclear que modula l'homeòstasi del zinc.<br/>Per explicar aquests resultats, proposem que catequines i procianidines poden actuar tant<br/>com a segrestadors de zinc -evitant la seva entrada a la cèl·lula a través dels transportadors<br/>de zinc de membrana plasmàtica-, com d'ionòfors de zinc -cotransportant cations zinc a<br/>través de la bicapa lipídica i incrementant així els nivells de zinc làbil citoplasmàtic. La<br/>repressió de gens MT induïda per l'activació de FXR per GSPE podria també contribuir a<br/>l'increment de zinc làbil, en impedir que els cations zinc siguin segrestats per apo-tioneïna<br/>sintetitzada de novo.<br/>Donat el paper del zinc làbil com a modulador de múltiples víes de senyalització i<br/>metabòlics, formulem la hipòtesi que la quelació extracel·lular de cations de zinc i l'elevació<br/>de zinc làbil citoplasmàtic són mecanismes subjacents a l'activitat biològica de catequines i<br/>procianidines i, per tant, que les vies metabòliques i de senyalització afectades pel zinc làbil,<br/>ho seràn també per aquests flavonoids.<br/>Effects of dietary catechins and proanthocyanidins on zinc homeostasis in<br/>hepatic cells.<br/>Catechins and their polymers procyanidins are health-promoting flavonoids found in edible<br/>vegetables and fruits. They act as antioxidants by scavenging reactive oxygen species and<br/>by chelating the redox-active metals iron and copper. They also behave as signaling<br/>molecules, modulating multiple cell signaling and metabolic pathways and gene expression,<br/>including that of antioxidant enzymes. Previous results of the Nutrigenomics Reseach Group<br/>showed that an oral acute dose of a grape-seed procyanidin extract (GSPE) represses the<br/>expression of the zinc-binding protein metallothionein (MT) genes in rat liver, and enhances<br/>the expression of the orfan nuclear receptor small heterodimer partner (SHP/Nr0b2) (Del Bas<br/>et al., 2005). In addition, it was shown that procyanidins act as transcriptional coactivators of<br/>the nuclear bile acid receptor Farnesoid X Receptor (FXR), which in turns upregulates SHP<br/>expression, thereby exerting an hypotrygliceridemic effect (Del Bas et al., 2008; Del Bas et<br/>al., 2009).<br/>The objectives of this Ph.D. Thesis were to determine whether catechins and procyanidins<br/>interact with the redox-inactive metal zinc, to evaluate their effect on zinc homeostasis in<br/>hepatic cells -including the expression of MT genes, used here as a biomarkers of<br/>procyanidin activity in hepatic cells-, and to disect the mechanisms by which procyanidins<br/>affect cellular zinc homeostasis, in particular to asses whether MT genes are targets of SHP<br/>and FXR.<br/>Our results show that GSPE, as well as individual catechins and procyanidins tested,<br/>including the green tea flavonoid (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), bind zinc cations in<br/>solution with higher affinity than the zinc-specific chelator Zinquin. In human<br/>hepatocarcinoma HepG2 cells, GSPE inhibits intracellular zinc accumulation and counteracts<br/>the toxic effects of excess zinc on cell viability. At the mRNA expression level, GSPE<br/>downregulates MTs and zinc-efflux transporters while upregulating zinc-influx transporters.<br/>Zinc importers of the Trans-Golgi network are upregulated by GSPE. In addition, GSPE<br/>blocks the induction of MTs expression by the proinflammatory cytokine IL-6, the ROS<br/>generator tBOOH, the glucocorticoid receptor agonist dexamethasone, and the metals<br/>copper and zinc.<br/>EGCG reproduces the major effects of GSPE on zinc homeostasis in HepG2, downreguling<br/>the expression of MTs and zinc-efflux transporters, while upregulating the expression of zincinflux<br/>transporters, concomitantly inhibiting intracellular zinc accumulation and the toxicity of high zinc doses. Procyanidin dimer B1 and trimer C1 behave opposite to GSPE and EGCG<br/>with regard to MT expression and intracellular zinc accumulation in HepG2 cells.<br/>Concerning cytoplasmic labile zinc, the tiny fraction of total cellular zinc that modulates<br/>signaling and metabolic pathways, we found that GSPE, EGCG and trimeric procyanidin C1<br/>greatly elevate Zinquin-detectable labile zinc in HepG2 cells.<br/>Experiments with SHP-null and FXR-null mice demonstrate that GSPE downregulates<br/>postprandial expression of MT genes in the liver, in a SHP-independent but FXR-dependent<br/>manner. In addition, chenodeoxycholic acid, a physiological ligand and activator of FXR,<br/>represses the expression of MT genes in HepG2 cells. Thus, MT genes are targets of FXR<br/>and, consequently, FXR is revealed as a modulator of zinc homeostasis.<br/>To explain these results, we postulate that catechins and procyanidis may act both as<br/>sequestrants of zinc -thereby impeding the entrance of zinc cations to the cell through<br/>plasma membrane zinc transporters-, and as zinc ionophores -thereby cotransporting zinc<br/>cations through the lipid bilayer and increasing the levels of cytoplasmic labile zinc.<br/>Repression of MT expression by procyanidin-activated FXR might also contribute to the<br/>increment of the labile pool of zinc, by hindering the sequestration of zinc-cations by de novo<br/>synthesized apo-thionein.<br/>Given the role of labile zinc as modulator of multiple intracellular signaling and metabolic<br/>pathways, we forward the hypothesis that extracellular complexation of zinc cations and<br/>subsequent elevation of cytoplasmic labile zinc may be relevant mechanisms underlying the<br/>health-promoting activity of catechins and procyanidins and, therefore, that the signaling and<br/>metabolic pathways modulated by labile zinc will be aslo a target of these flavonoids.