Biochemistry and physiology of rehydration and adaptation of active dry wine yeast for winemaking.

Abstract

Alcoholic fermentation is a process mainly characterised by several factors that induce yeast stress response (low pH, high osmotic pressure, low nitrogen content, etc). Thus, stress response is essential to yeast in order to assure its survival, adaptation and growth, in both natural habitats and industrial conditions such as winemaking. One of the main features to optimise and improve alcoholic fermentation is the establishment of metabolic and physiological changes by the yeast just after must inoculation. In this early phase, yeast must quickly change its metabolism to achieve maximum advantage in the new growth medium. Oenological industry uses selected active dry wine yeast (ADWY) to inoculate the musts in order to get a better control over the fermentation process. Those dry yeasts have to be rehydrated before must inoculation. Therefore, yeast rehydration is the first step to ensure healthy cells and a good fermentation performance. The knowledge of the early yeast metabolic responses, from a biochemical and physiological point of view, were the main objectives of this thesis. The studied objectives were:<br/><br/> Analysis of trehalose and glycogen metabolism (reserve carbohydrates) in a commercial wine yeast strain, considering these carbohydrates markers of stress response. Study of their metabolism in winemaking conditions, taking into account the fermentation temperature (low 13ºC and control 25ºC), nitrogen content (low 60 mg/l, control 300 mg/l and high 1200 mg/l) and the ADWY rehydration and pre-adaptation.<br/><br/> Determination of early transcriptional responses of yeast just after must inoculation. It was considered the presence of glucose and fructose, the osmotic shock and the yeast metabolic activation, including the presence of the drug Cycloheximide, which is an inhibitor of protein synthesis.<br/><br/> Characterisation of the standard protocol of ADWY rehydration in an oenological context, which is rehydrate in warm water (37ºC) during 30 minutes.<br/><br/>Low fermentation temperatures affected fermentation kinetics, but not induced any additional stress response. In fact, high levels of trehalose were accumulated at control temperature than at 13ºC. In industrial conditions, after a period of pre-adaptation before inoculation, carbohydrates were completely depleted once yeasts were inoculated into the must. Their synthesis started simultaneously with a change in the phase of growth, from exponential to stationary, coinciding with nitrogen depletion. <br/>We also studied rehydration and characterised the early response to synthetic must but also to relevant conditions that ADWY must cope after inoculation (osmotic shock, presence of carbon sources). Glycogen content did not presented any change. However, trehalose was early mobilised in those media capable to ensure yeast growth. <br/>The effect of nitrogen availability upon trehalose metabolism was also studied. Neither glucose nor nitrogen exhaustion were involved in the regulation of trehalose metabolism. TPS1 (gene which codifies for trehalose-6-phosphate synthase) was induced just before trehalose accumulation, simultaneously with growth arrest. Microarray technique was used to determine whole gene expression after rehydration and in the same conditions previously studied. We can conclude that 30 minutes of rehydration in water is enough for the yeast to fully recover and that longer times in this medium are detrimental. The yeast transcriptional switch is the presence of fermentable sugars, and this is mostly related to ribosome and protein synthesis, glycolysis and ethanol synthesis.

La fermentació alcohòlica és un procés bàsicament caracteritzat per una sèrie de factors que indueixen estrès al llevat, el microorganisme responsable de la seva consecució. La resposta a estrès per part del llevat és essencial per a la seva supervivència, adaptació i creixement, tant en medis naturals com en processos industrials (enologia). Una de les principals característiques per a l'optimització de la fermentació alcohòlica és l'establiment de canvis metabòlics i fisiològics del llevat just després de la inoculació en el most. És en aquesta fase inicial quan el llevat ha de canviar ràpidament el seu metabolisme per tal d'adquirir el màxim d'avantatge en el nou medi de creixement. La indústria enològica disposa de llevats secs actius (LSA) seleccionats que s'inoculen al most per tal d'assolir un millor control sobre el procés fermentatiu. Aquests llevats secs requereixen d'una rehidratació prèvia a la inoculació en el most. La rehidratació és el primer pas per tal d'assegurar el bon estat cel.lular i una bona fermentació alcohòlica. El coneixement de les respostes metabòliques inicials del llevat des d'un punt de vista bioquímic i fisiològic foren els objectius fonamentals d'aquest treball. Els objectius van ésser:<br/><br/>- Anàlisi del metabolisme de trehalosa i glicogen (carbohidrats de reserva) en una soca de llevat comercial, com a indicadors de resposta a estrès. Estudi del metabolisme en condicions víniques, considerant com a variables la temperatura de fermentació (baixa, 13ºC i control, 25ºC), contingut en nitrogen (baix 60 mg/l, control 300 mg i elevat 1200 mg/l) i la rehidratació i preadaptació del LSA.<br/>- Determinació de les respostes transcripcionals inicials del llevat immediatament després de la seva inoculació en el most. Es va considerar la presència de glucosa i fructosa, el shock osmòtic i l'activació metabòlica del llevat, incloent la presència de cicloheximida, un inhibidor de la síntesi proteica.<br/>- Caracterització del protocol estàndard de rehidratació del llevat dins el context enològic, que és la utilització d'aigua a 37-40ºC durant 30 minuts. <br/><br/>Les baixes temperatures de fermentació van incidir sobre la cinètica fermentativa, però no sobre una resposta a estrès. De fet, es va trobar major acumulació de trehalosa a temperatura control que a 13ºC. En condicions industrials, després d'un període d'adaptació previ a la inoculació (peu de cuba), els nivells de carbohidrats van ser nuls. La seva síntesi es va produir al canvi de fase exponencial a estacionària, coincidint amb l'esgotament de nitrogen. Es va estudiar la rehidratació i permanença en diferents medis (aigua, glucosa/fructosa, most sintètic i sorbitol). La concentració intracel.lular en glicogen no presentà cap modificació. Però la trehalosa es va metabolitzar en les fases inicials, en aquells medis favorables per al creixement del llevat.<br/><br/>Es va estudiar l'efecte de la disponibilitat de nitrogen sobre el metabolisme de la trehalosa. Independentment del contingut nitrogenat, el seu metabolisme no es va veure modificat. TPS1 (gen que codifica trehalosa-6-fosfat sintasa) es va induir just abans de la acumulació de trehalosa, coincidint amb l'aturada del creixement cel.lular. Mitjançant la tècnica dels "microarrays" es va determinar l'expressió gènica global del llevat després de rehidratar i romandre en els medis anteriors. Podem concloure que el temps de rehidratació utilitzat en enologia assegura la total recuperació de LSA. Temps més llargs afectaren negativament la fisiologia del llevat, reduint significativament la seva vitalitat. Les modificacions transcripcionals al most foren degudes bàsicament a la presència de glucosa i fonts nitrogenades, induint la síntesi proteica, glucòlisi i producció d'etanol.