Engineering biocompatible surfaces from the nano to the micro scale

Abstract

One of the important challenges in surface bioengineering is the fabrication of robust and regular supramolecular structures, tuning the chemical and topographical properties of the surface, in order to include functional biomolecules, which preserve their activity and/ or induce the desired biological process.<br/>Laccases, are redox enzyme, that catalyse the oxidation of a broad range of polyphenols and aromatic substrates. Wide variety of application in the industry has been reported, and lately their use for biosensors development. <br/>Bacterial S-layers are very interesting systems since they self-assemble forming 2-D crystals (S-layers) on many type of surfaces, and they can be fused with other biomolecules maintaining their functionality.<br/>HegG2 cell line is an hepatoma cell line that has been used for cancer research. These cells maintain part of the normal metabolic capacity of hepatocytes, what make them a useful tool for high-throughput in vitro toxicity assays, as well as in the development of bioartificial livers. <br/>The objective of this work was to generate biocompatible surfaces to immobilise lacase, S-layers and HepG2 cells, on which they mantain they active. <br/>Different surfaces with defined functionalities have been constructed with synthetic polyelectrolytes, using the layer-by-layer technique and soft lithography. At the nanoscale, an enzyme (laccase) was covalently immobilised on a gold/polyethylenimineI/glutaraldhyde layer, preserving its activity. The immobilisation was studied with a quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and its activity assayed with a spectrophotometer.<br/>Besides, bacterial surface proteins (SbpA, SbpA-EGFP and SbpA-STV) were adsorbed on polyelectrolytes multilayers. The combination of soft-lithography with a protein resistant polyelectrolyte (PLL-g-PEG) led to the construction of micro-structured surfaces of functional bacterial proteins. Surface wetability, fluorescence and atomic force microscopy (AFM) were used to characterise those interfaces.<br/>Increasing the complexity, attachment of HepG2 cells on polyelectrolytes was studied. Cell adopted different morphologies depending on the hosting underlying polyelectrolyte as observed by transmission, scanning electron and atomic force microscopes. The adhesion and spreading of the cells that were monitored with QCM-D and transmission microscopy, and assayed with crystal violet, showed a higher affinity of the cells toward the adlayer formed on PEI, PAH and PLL in comparison with PSS and PLL-g-PEG. Force spectroscopy studies with AFM showed higher repulsion between PSS surfaces and the cell surface, and different local cell mechanical properties between cells attached to PEI and PSS.

La ingeniería de biomateriales busca obtener materiales biológicamente activos, ajustando las propiedades químico-físicas (y topográficas) de la superficie de interés. <br/>Las lacasas, son enzimas que catalizan la oxidación de un gran número de polifenoles con aplicación en la industria, así como en el desarrollo de biosensores. Las proteínas bacterianas S, son sistemas muy interesantes ya que se auto-ensamblan formando cristales en 2-D y se pueden fusionar con otras biomoléculas. La línea celular hepática cancerosaHepG2, se ha empleado en estudios relacionados con el cáncer, citotoxicidad , se ha incorporado en dispositivos extracorporales para suplir funciones hepáticas, ya que a pesar de su transformación mantienen ciertas funciones de los hepatocitos normales. <br/>El objetivo de este trabajo fue generar superficies biocompatibles en las que se inmovilizó lacasa y se adsorbieron proteínas (de fusión) bacterianas y células, comprobando su funcionalidad.<br/>El ajuste de la química superficial se realizó por adsorción capa tras capa de polielectrolitos y para su estructuración se utilizó litografía blanda ("micro-contact printing"). La lacasa se inmobilizó covalentemente sobre oro cubierto con PEI (polietilenimina) través de gluraldehído, para posteriormente recubrirla con otros polielectrolitos. Dicho proceso se monitoreó con QCM (microblanza de cuarzo) y espectrofotometría (actividad enzimática). Las proteínas bacterianas se adsobieron selectivamente sobre muliticapas de polielectrolitos previamente estructuradas. Su funcionalidad se comprobó usando AFM (microscopía de fuerza atómica) y microscopía de fluorescencia. Las células HepG2 se inmobilizaron sobre superficies homogéneas y estructuradas de con distintos polielectrolitos. Se comprobó su viabilidad por ensayos con MTT y se observaron con SEM (microscopía de escaneo de electrones). El proceso de adhesion de las células sobre las multicapas de polielectrolos se estudió en función del tiempo con QCM y microscopía de transmisión, y fue testado con cristal violeta. Se utilizó AFM para estudiar la interacción entre las células con los polielectrolitos.<br/>El protocolo de inmovilización usado es aplicable para la lacasa, la cual conserva su actividad catalítica en la presencia de ABTS. La enzima se recubrió con multicapas de polielectrolitos pero la determinación de su actividad se ve dificultada por la interferencia con el ABTS.<br/>Por primera vez se utilizó "micro-contact printing" para construir superficies estructuradas, en las que se adsorbieron proteínas (de fusión) S, generando superficies funcionales en escala nanométrica dentro de microestructuras. Cabe destacar que la posibilidad de manipular la distribución de la proteína en escala micro es un requerimiento básico para el desarrollo de biosensores. <br/>En lo que se refiere a la interacción célula/superficie, se encontró que las células HepG2 adoptan diferente morfología dependiendo del substrato al que se adhieren. Mientras polielectrolitos positivos (PEI, PAH) adsorben moléculas que inducen la expansión celular, PLL-g-PEG (interfase neutra e hidrofílica) y PSS (polielectrolito negativo) no favorecieron la expansión celular. El QCM-D revelan que las células no son detectadas cuando se depositan sobre PSS (lo opuesto sucede cuando se adhieren sobre PEI) aunque se mantiene adheridas. Las propiedades mecánicas de las células varían de acuerdo al sustrato al que se adhieren, más rígidas sobre PEI. La máxima adhesión de las puntas (funcionarizadas con PEI y PSS) del AFM a la superficie celular es independiente de la carga aplicada y de su recubrimiento, para un tiempo nulo de residencia de la punta sobre la superficie celular. La máxima adhesión observada fue de 750 pN para un tiempo de residencia de residencia de 3 s, cuando el tip fue funcionalizado con PEI.