Colloidal and molecular assemblies for bioengineering applications

Author

Pescador Álvarez, Paula

Director

Katakis, Ioanis

Date of defense

2007-12-20

Legal Deposit

T-389-2008



Department/Institute

Universitat Rovira i Virgili. Departament d'Enginyeria Química

Abstract

La técnica de recubrimiento "capa por capa' (layer-by-layer, LbL) de superficies cargadas mediante materiales con carga opuesta es una herramienta versátil para la fabricación de ensamblados moleculares e interfaces funcionales. Sus principales ventajas sobre otras metodologías, como las monocapas autoensambladas (SAM) o la técnica de Langmuir-Blodgett, son una enorme flexibilidad combinada con su gran simplicidad y bajo coste. Con instrumentación sencilla y protocolos de preparación simples, es posible ensamblar estructuras complejas y estables con un control nanométrico sobre su composición y estructura.<br/>La metodología LbL es especialmente adecuada para la integración de biomoléculas (proteínas, lípidos, DNA) en multicapas funcionales, ya que el proceso de ensamblaje se lleva a cabo en condiciones suaves. Las propiedades biológicas de estos materiales se mantienen o incluso mejoran tras su incorporación en los films.<br/>Otra ventaja de esta técnica es que permite recubrir sustratos de virtualmente cualquier tamaño y forma con films funcionales de manera sencilla y controlada. De particular importancia ha sido la extensión del método a la modificación de partículas coloidales. Aparte de su interés desde un punto de vista fundamental y aplicado, los coloides constituyen herramientas de gran potencial para la creación de estructuras de diseño específico en los campos de la bio y nanotecnología. La funcionalización vía LbL de partículas coloidales permite integrar múltiples funcionalidades en las partículas, y proporciona además una ruta para la creación de estructuras tridimensionales que facilitan la transición desde la nano- a la micro- y macroescala.<br/>La técnica LbL ha supuesto también un gran avance en el desarrollo de sistemas electroquímicos. Diversos materiales electroactivos pueden ser incorporados en las multicapas, junto con otras especies que proporcionan funcionalidades adicionales. Además, parámetros críticos como el grosor del film, el transporte de materia y la conductividad pueden ajustarse con precisión en estas estructuras, incrementando la capacidad de control sobre el funcionamiento final del sistema. En particular, las estructuras LbL han encontrado numerosas aplicaciones en el área de los biosensores electroquímicos. Estos dispositivos proporcionan una interfaz entre funciones biológicas específicas y procesos de transducción electrónicos, y ofrecen una alternativa con gran potencial para el desarrollo de plataformas de biodetección integradas.<br/><br/><br/>En el presente trabajo, la técnica LbL se emplea para ensamblar films multicapa de enzimas y polielectrolitos en la superficie de micropartículas de sílice. Dos enzimas diferentes, glucosa oxidasa (GOx) y peroxidasa (HRP) son co-inmovilizadas junto con capas precursoras e intermedias de polielectrolitos. En los films resultantes se desarrolla una reacción enzimática secuencial, con la conversión inicial de glucosa en acido glucónico y peróxido de hidrógeno, catalizada por GOx, y la posterior reducción del peróxido de hidrógeno a agua por acción de la HRP. El enfoque secuencial LbL permite explorar la influencia de diferentes combinaciones de polielectrolitos sobre la inmovilización y funcionalidad de los enzimas. Técnicas como la citometría de flujo, microscopía confocal y electrónica y medidas espectrofotométricas proporcionan información sobre la interacción entre los diferentes componentes de las capas, así como sobre la estabilidad de las suspensiones coloidales y el comportamiento de los films en presencia de los diferentes sustratos enzimáticos.<br/>Una funcionalidad electroquímica se integra adicionalmente en estos films mediante la incorporación de un polímero redox a la estructura. De este modo, los eventos específicos que tienen lugar durante la catálisis enzimática se transducen en una señal eléctrica. Las partículas nanoestructuradas asumen un doble papel en el sistema final. Por una parte, actúan como sustratos de alta área superficial para la fabricación de microreactores enzimáticos. Además, los coloides se incorporan en un film de polímero redox y se inmovilizan en la superficie de electrodos de oro, actuando como elementos de construcción para la fabricación de un biosensor electroquímico que permite la detección de glucosa y peróxido de hidrógeno.


The layer-by-layer (LbL) coating of charged surfaces with oppositely charged materials is a powerful and versatile approach for the fabrication of functional molecular assemblies and interfaces. The key advantages of this technique over other methodologies such as self-assembled monolayers (SAM) or Langmuir-Blodgett (LB) are its unparalleled flexibility in combination with its simplicity and inexpensiveness. With simple instrumentation and easy preparation steps it is possible to assemble highly complex and stable architectures with nanoscale control over their composition and structure.<br/>The LbL approach is particularly suitable for the integration of biomolecules (proteins, lipids, DNA) into functional multilayers, since layer buildup is carried out under mild conditions. Many biologically relevant species can be incorporated into the films while maintaining or even improving their biological functions. A further advantage of this technique is that substrates of virtually any size and shape can be coated with functional films in a simple and controlled fashion. Of particular interest has been the extension of the LbL method to the modification of colloidal particles. Apart from their interest from a fundamental and applied point of view, colloids have emerged as powerful tools particularly suited to meet the challenge of creating tailored building blocks for the rapidly evolving fields of bio- and nanotechnology. The LbL functionalisation of colloidal particles provides a new route for the creation of composite architectures which allow the integration of nanoscale-defined materials into two- and three-dimensional structures. This ultimately opens the way not only to functional microsystems but also to the fabrication of macroscopic devices.<br/>One of the fields in which the LbL technique has represented a major advance is the development of electrochemical systems. Electrochemically active materials can be readily incorporated into multilayer films, together with other species which provide additional functionalities. Furthermore, critical parameters such as film thickness, mass transport and conductivity can be precisely tuned, allowing an increased control over the performance of the system. In particular, LbL assemblies have found many successful applications in the area of electrochemical biosensors. These devices provide an interface between biological functions and electronic signal-transduction processes, and offer great potential for the development of new miniaturised, low-cost, integrated biodetection platforms.<br/><br/>In the present work, the LbL technique is employed to assemble multilayer films of enzymes and polyelectrolytes on the surface of silica microparticles. Two different enzymes, glucose oxidase (GOx) and horseradish peroxidase (HRP) are co-immobilised together with precursor and intermediate polyelectrolyte layers. In the resulting multilayer films a sequential reaction takes place, with the conversion of glucose to gluconic acid and hydrogen peroxide catalysed by GOx and the subsequent reduction of hydrogen peroxide to water catalysed by HRP. The sequential LbL approach allows to explore the influence of different polyelectrolyte combinations on the immobilisation and functionality of the enzymes. Flow cytometry, confocal and electron microscopy and spectrophotometric measurements provide information about the interaction between the different layer components, as well as the stability of the colloidal substrates and the behaviour of the multilayer films in the presence of the different enzyme substrates.<br/>An electrochemical functionality is further added to these films with the incorporation of an osmium-based redox polymer to the structure. In this way the specific chemical events taking place at the redox centers of the enzymes are transduced into an electrical signal. The nanostructured particles assume a multiple role in the final system. On one hand, they act as immobilisation substrates and high surface area carriers for the creation of enzymatic microreactors. Moreover, the LbL-coated colloids are embedded in a redox polymer film and immobilised on the surface of gold electrodes, acting as building blocks fo the fabrication of an electrochemical biosensor able to detect glucose and hydrogen peroxide.

Keywords

Electrochemistry; Biosensors; Colloids; Enzymes

Subjects

517 - Analysis; 543 - Analytical chemistry; 577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics; 62 - Engineering. Technology in general

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