DNA methylation (5-methylcytosine, 5-meC) is an important epigeneticmark for transcriptional gene silencing that plays critical roles in regulation ofdevelopmental genes, genomic imprinting, X chromosome inactivation andtransposon silencing. Methylation landscapes are established by the combinedactions of methylation and demethylation reactions. The mechanismsresponsible for active DNA demethylation in mammalian cells are still poorlyunderstood. However, in plants there is convincing genetic and biochemicalevidence that a subfamily of DNA glycosylases typified by Arabidopsis ROS1(REPRESSOR OF SILENCING 1) remove 5-meC from DNA, initiating itsreplacement by unmethylated cytosine through a base excision repair (BER)process. After 5-meC removal, ROS1 and its homologous cleave thephophodiester backbone, generating a substantial fraction of productscontaining a single-nucleotide gap flanked by 3´- and 5´-phosphate termini. Inthis work, it has been found that the DNA phosphatase ZDP removes theblocking 3´-phosphate, allowing subsequent DNA polymerization and ligationsteps needed to complete demethylation. ZDP and ROS1 interact in vitro and colocalizein vivo in nucleoplasmic foci. It has also been found that extracts fromzdp mutant plants are unable to complete DNA demethylation in vitro, andmutations in ZDP cause DNA hypermethylation and transcriptional silencing of areporter transgene. Furthermore, genome-wide methylation analysis in zdpmutant plants identified hundreds of hypermethylated endogenous loci. Ourresults also indicate that, besides a role during DNA demethylation, ZDPparticipates in the repair of DNA damage, probably by processing single-strandbreaks (SSB) generated either directly by DNA-damaging agents or indirectly asrepair intermediates. This work also examined the possible role of plant XRCC1(X-ray cross complementing group protein 1) in DNA demethylation. Our resultssuggest that XRCC1 is a component of plant BER and functions at several stagesduring active DNA demethylation. Thus, XRCC1 interacts with ROS1 and ZDPand stimulates their enzymatic activities in vitro. By other hand, cell extractsfrom xrcc1 mutant plants exhibit a reduced capacity to complete DNAdemethylation, and XRCC1 is required for efficient gap-tailoring and DNAligation. Altogether, the results show that ZDP and XRCC1 function downstreamof ROS1 in the active DNA demethylation pathway in plants, and contribute to understand the role of DNA repair mechanisms in the modification of epigeneticpatterns.

La metilación del DNA (5-metilcitosina, 5-meC) es una marca epigenéticaque promueve el silenciamiento génico y desempeña un papel importante en laregulación del desarrollo, la impronta génica, la inactivación del cromosoma X yel silenciamiento de elementos transponibles. Los patrones de metilación seestablecen por la acción combinada de mecanismos de metilación ydesmetilación. Los mecanismos responsables de la desmetilación activa del DNAen animales no se conocen con exactitud. Sin embargo, en plantas hayconvincentes pruebas genéticas y bioquímicas de que proteínas de unasubfamilia de DNA glicosilasas, tipificadas por la proteína de ROS1 (REPRESSOROF SILENCING 1) de Arabidopsis, eliminan la 5-meC del DNA, iniciando susustitución por una citosina no metilada a través de un proceso análogo a lareparación por escisión de bases (Base Excision Repair, BER). Tras laeliminación de la 5-meC como base libre, ROS1 y sus homólogos rompen elesqueleto azúcar-fosfato del DNA, generado entre otros productos un huecomono-nucleotídico flanqueado por extremos 3´-P y 5´-P. En esta tesis doctoralse ha demostrado que ZDP, una fosfatasa de DNA, procesa el grupo 3´-P ygenera un extremo 3´-OH que puede ser usado por DNA polimerasas pararellenar el hueco y completar la desmetilación. ZDP y ROS1 interaccionan invitro y co-localizan in vivo en las mismas regiones nucleoplásmicas. También seha demostrado que plantas mutantes zdp son incapaces de completar ladesmetilación in vitro, y que las mutaciones en ZDP causan la hipermetilación yel consiguiente silenciamiento transcripcional de un transgén reportero. Además,un análisis de metilación a escala genómica ha revelado que el DNA de plantasmutantes zdp contiene cientos de regiones que se encuentran hipermetiladas.Por otra parte, los resultados de este trabajo indican que ZDP tambiéndesempeña un papel en la reparación de daños en el DNA, probablementeprocesando roturas de cadena sencilla generadas directamente por agentesgenotóxicos o surgidas indirectamente como intermediarios de reparación.También se ha examinado el posible papel de XRCC1 (X-ray crosscomplementing group protein 1) en la ruta de desmetilación activa de DNA.Nuestros resultados indican que XRCC1 es un componente del mecanismo deBER en plantas y que participa en varias etapas de la desmetilación. XRCC1interacciona con ROS1 y ZDP, estimulando las actividades enzimáticas de ambasproteínas in vitro. Los extractos celulares de plantas mutantes xrcc1 muestran una menor capacidad de completar la desmetilación, y XRCC1 facilita tanto laeliminación del grupo 3´-P catalizada por ZDP como el paso final de ligación delDNA. En definitiva, los resultados de esta tesis demuestran que ZDP y XRCC1funcionan con posterioridad a ROS1 en una ruta de desmetilación activa del DNAen plantas, y contribuyen a entender el papel de la maquinaria de reparación delDNA en la modificación de los patrones epigenéticos.