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Abstract:
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Se realizó la búsqueda, clonación y expresión de los genes ζ-caroteno desaturasa (zds-Fc) ylicopeno β-ciclasa (β-lyc-Fc) de Ficus carica. Estos genes catalizaron la desaturación del ζ-caroteno y neurosporeno para producir licopeno, y la ciclación del licopeno para producir β-caroteno, respectivamente. El gen zds-Fc presentó un marco de lectura abierto de 1746 pb quecodifica una proteína de 582 aminoácidos con un peso molecular de 64 kD. El gen β-lyc-Fcpresentó un marco de lectura abierto de 1488 bp que codifica un polipéptido de 496aminoácidos con un peso molecular de 56 kD. El análisis de sus secuencias reveló una altahomología y motivos conservados con otras desaturasas y ciclasas descritas en plantas. Elanálisis de la actividad enzimática se realizó mediante ensayos de complementación heterólogaen Escherichia coli y se confirmó por HPLC-PDA. Hasta ahora, estos son los primeros genes decarotenogénesis descritos en F. carica. Como ensayo en sistema eucariota, se construyeron tresnuevas cepas recombinantes de Pichia pastoris, (Pp-EBI, Pp-EBIL, Pp-EBILWZ) capaces deproducir licopeno, β-caroteno y astaxantina, respectivamente. Para esto, se diseñaron yconstruyeron los plásmidos recombinantes, pGAPZA-EBI*, pGAPZA-EBI*L*, pGAPZA-WZque contenían los genes, geranilgeranil difosfato sintetasa (crtE), fitoeno sintetasa (crtB) yfitoeno desaturasa (crtI) de Erwinia uredovora, licopeno β-ciclasa (crtL o β-lyc-Fc) de F.carica, y β-caroteno ketolasa (crtW) y β-caroteno hidroxilasa (crtZ) de Agrobacteriumaurantiacum. Finalmente, se logró por primera vez en la levadura P. pastoris la producción deβ-caroteno y astaxantina, aportando una fuente microbiológica alternativa para la biosíntesis decarotenoides. |