Análisis funcional de Cabut, un factor de transcripción implicado en el cierre dorsal de Drosophila

Abstract

El cierre dorsal (CD) es uno de los últimos procesos morfogenéticos de la embriogénesis de Drosophila y que consiste en el cierre del agujero más dorsal que presenta el embrión durante el estadio 13 de su desarrollo. Para ello, las capas epiteliales laterales migran mientras que la amnioserosa se contrae e invagina. Este proceso necesita de la coordinación de la epidermis, la amnioserosa y el vitelo, así como de reestructuraciones en el citoesqueleto celular, la polarización de las células epidérmicas más dorsales, la formación de filopodios y lamelipodios y la activación de rutas de transducción de señal como la de las JNKs. El CD es el proceso más estudiado de la extensión y fusión de epitelios y comparte muchas similitudes con el proceso de curación de heridas en vertebrados. cabut (cbt), es un gen que codifica un factor de transcripción necesario para que se produzca el CD. cbt se expresa en la epidermis y el vitelo actuando bajo el control de las JNKs y regulando la expresión del gen decapentaplegic en el leading edge. Las proteínas ortólogas a Cbt en vertebrados pertenecen a la familia de factores de transcripción TIEG, que han sido descritos como inhibidores de la proliferación celular y asociados a diferentes tipos de procesos cancerosos. Cbt está relacionado con otros procesos como el ciclo circadiano, la regeneración de discos imaginales, el control del ciclo celular, el crecimiento celular, la remodelación neuroendocrina y la respuesta a la ecdisona la guía de axones y sinaptogénesis. En esta tesis doctoral se han generado diferentes herramientas genéticas, bioquímicas e inmunológicas para poder realizar diferentes aproximaciones que nos lleven a dilucidar cuales son las funciones de Cbt durante el desarrollo embrionario así como sus dianas transcripcionales y cuales son los dominios funcionales responsables de su actividad. Para ello se generó un anticuerpo que reconoce de forma específica a Cbt y se realizaron ensayos de Inmunodetección así como de Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP‐on‐chip). Esto ha permitió realizar un estudio amplio del patrón de expresión embrionario de la proteína, tanto durante el CD como en otros estadios del desarrollo, demostrando que Cbt no solo se expresa en los núcleos de la epidermis, el vitelo y el intestino posterior durante el CD, sino también en los núcleos de la amnioserosa a través de la ruta de las JNKs. Además se han descrito nuevos patrones de expresión de Cbt en embriones tempranos, en el sistema nervioso central y periférico embrionario‐larvario sugiriendo nuevas funciones de esta proteína. A nivel estructural y mediante ensayos en cultivo celular, se ha determinado que la señal de transporte al núcleo de Cbt se encuentra en el N‐terminal y corresponde al motivo 71PNKKPRL77, siendo imprescindibles para este transporte las lisinas K73K74. Además, se ha podido determinar que, al igual que las proteínas TIEG, Cbt puede actuar como activador y/o represora de la transcricpión. Por último, mediante microarrays en embriones mutantes cbt durante el CD, hemos demostrado que la expresión de Cbt en la epidermis está regulada por la ruta de señalización de la ecdisona y que, a su vez, Cbt regula la expresión de más de 1000 genes entre los que se encuentran Tm2, InR, fas y los genes inducibles por ecdisona ImpE1 e ImpL1. Asímismo, los ensayos de ChIP‐on‐chip han mostrado que Cbt es capaz de unirse a varias regiones genómicas entre las que se encuentran su propio promotor y el promotor del gen NPC1a, implicado en el tráfico de lípidos. Estos resultados sugieren que la ecdisona está implicada en el CD, a través de Cbt, y que el transporte de lípidos podría tener un papel importante en el mismo

cabut (cbt) encodes a transcription factor involved in Drosophila dorsal closure (DC), and it is expressed in embryonic epithelial sheets and yolk cells during this process upon activation of the Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway. Additional studies suggest that cbt may have a role in multiple developmental processes, such as neuroendocrine cell remodeling, ecdysone response, circadian rhythm, axon guidance, synaptogenesis, cell growth and cell cycle. The vertebrate orthologes of Cbt, the family of TIEG transcription factors, are involved in proliferation and cancer. In this thesis, we have generated different genetic, biochemical and immunological tools for the study of the function of Cbt during fly development, its transcriptinal targets and the structural domains responsible for its function. To analyze Cbt subcellular localization throughout embryogenesis, as well as Cbt´s transcriptional targets, we generated a Cbt-specific antibody that allowed us to (1) detect new Cbt expression patterns and (2) perform Chromatin Immunoprecipitation assays followed by microarray analyses (ChIP-on-chip). Immunohistochemical analyses during DC revealed that Cbt is expressed in the yolk, epidermal and amnioserosal cells, which contribute to the DC process. Also, Cbt is expressed in the central and peripheral nervous system. Moreover, cell culture assays have determinated that the 71PNKKPRL77 motif of Cbt functions as a nuclear localization signal (NLS), and that the conserved TIEG´s NLS, is not functional in insects. Direct mutagensis demonstrated that K73 and K74 residues are necessary for Cbt transport to the nucleus. Whole embryo microarray analyses of cbt mutants during DC were performed, and they revealed that Cbt regulates more than 1000 genes during the DC process, such as the 20-hydroxyecdysone hormone (20E)-inducible genes ImpE1 and ImpL1. Indeed, 20E regulates Cbt in the epidermis. Finally, ChIP-on-chip studies showed direct binding of Cbt to genomic regions close to Cbt and NPC1a (Niemann-Pick Type C-1) genes, which regulate trafficking of sterols through endocytic/secretory pathway. Taken together, these results suggest that 20E and lipid trafficking are involved in the DC through Cbt.