Analysis of the contribution of Barrier-to-Autointegration Factor (BAF) to centromere function and mitosis progression

Abstract

This work is focused on Barrier-to-Autointegration Factor (BAF) protein. BAF is a nuclear envelope (NE) component that binds chromatin and is required for NE reassembly (NER) at mitosis exit. Previous work in our group showed that, in Drosophila, a small fraction of BAF (cenBAF) associates with the centromere. BAF function is regulated by cycles of phosphorylation and dephosphorylation. At the entry of mitosis, BAF is phosphorylated by VRK1/NHK1 kinase and is released from chromatin and the NE. At mitosis exit, protein phosphatase 2A (PP2A) dephosphorylates BAF, which resumes binding to chromatin and promotes NER. Here, we find that cenBAF remains bound to the centromere during mitosis by the action of protein phosphatase 4 (PP4), which is recruited to the centromere by the constitutive centromere component CenpC. At the same time, BAF stabilizes CenpC and PP4 at the centromere forming a functional centromeric network essential for faithful chromosome segregation. Disrupting centromeric localization of PP4 destabilizes cenBAF at centromeres and induces ectopic PP2A-mediated dephosphorylation of free phosphoBAF (pBAF) in mitosis, which results in the accumulation of BAF in a perichromosomal layer surrounding the chromosomes. Concomitantly, NE disassembly/reassembly during mitosis is altered resulting in micronuclei formation and cells with altered NE morphology. This suggests that CenpC, PP4 and cenBAF form a centromeric network that signals pBAF dephosphorylation at mitosis exit by regulating PP2A activity. We also identify T4 and S5 as the main BAF phosphosites in Drosophila and study the actual contribution of PP4 and PP2A to pBAF dephosphorylation.

El present treball se centra en l'estudi de la proteïna Barrier-to-Autointegration Factor (BAF). BAF és una proteïna de la membrana nuclear (MN) que s'uneix a la cromatina i té un paper essencial en el reassemblatge de la MN al final de la mitosi. BAF ha estat descrit per primer cop en el nostre grup com una nova proteïna centromèrica (cenBAF) a Drosophila. La localització de BAF durant el cicle cel·lular està regulada per cicles de fosforilació i defosforilació. A l'entrada de mitosi BAF és fosforilat per la kinasa VRK1/NHK1 perdent la seva afinitat per unit cromatina i la MN. Aquesta situació es manté fins que PP2A desfosforila BAF al final de la mitosi, retornant al seu estat inicial. En el present treball es mostra que BAF es manté al centrómer durant la mitosi degut a l'acció de PP4 que és reclutada al centrómer per CenpC. Al seu torn cenBAF estabilitza la localització de CenpC i PP4 al centrómer formant un entramat centromèric responsable de garantir la correcta segregació dels cromosomes. L'alteració d'aquest entramat centromèric desemboca en la desregulació de l'activitat de PP2A sobre phosphoBAF (pBAF) soluble, observant-se com a resultat una acumulació de BAF desfosforilat envoltant els cromosomes a metafase i com a conseqüència, provocant la formació de micronuclis i alteracions en la morfologia nuclear. També hem indentificat T4 i S5 com els principals residus implicats en la fosforegulació de BAF a Drosophila i hem estudiat la contribució de PP4 i PP2A sobre la desfosforilació de BAF.