La presente tesis se enmarca en una de las líneas de investigación del Departamento de Ingeniería Textil y Papelera que se orienta a la Aplicación de la Biotecnología en los Procesos de Fabricación del Papel, en particular la aplicación de métodos biotecnológicos en la operación de Refinado para potenciar la modificación superficial de las fibras celulósicas mediante la utilización de enzimas, de manera que una respuesta positiva generará la obtención de una etapa de "biorefinado" aportando ventajas en la disminución del consumo energético -requerido por el refinado mecánico- y en la consecución de tecnologías limpias que cumplan con las leyes medioambientales.

En la investigación de nuevas técnicas biotecnológicas (enzimas) que se introducen en la operación de refinado se utilizan enzimas hidrolíticas (celulasas), y debido al gran auge de las enzimas oxidativas (lacasas) en los procesos de bioblanqueo se estudia la influencia indirecta que puede realizar sobre la morfología de las fibras y consecuentemente en el proceso de refinado y la calidad del papel. Los efectos de estas enzimas son evaluados en pastas kraft con secuencias de blanqueo ECF y TCF de Eucalyptus globulus.

La obtención de una etapa de "biorefinado" está influenciada por la efectividad de las enzimas en favorecer el proceso de refinado y, al mismo tiempo, depende de las variables del proceso, siendo la materia prima uno de los parámetros más importantes que modifica la aptitud al refinado; así lo revela el comportamiento diferencial de las pastas ECF y TCF donde la severidad de los procesos de obtención (cocción y blanqueo) confieren propiedades específicas a las fibras y, de acuerdo a las condiciones de operación, causarán mayor o menor alteración sobre la morfología de las fibras, de manera que estas alteraciones condicionaran la aptitud al refinado de las pastas. La comparación de los dos tipos de pastas permite afirmar que la secuencia TCF causa mayor cambio estructural en las fibras y, como consecuencia, se obtiene una más rápida respuesta en la operación de refinado.

En la pasta ECF, al potenciar su respuesta al refinado con la aplicación de la enzima Cel9B (1,4-β endoglucanasa) de Paenibacillus barcinonensis se revela un valor añadido al conseguir una aceleración de los efectos primarios y secundarios del refinado, y fenómenos como la mayor hidratación en la matriz interna de las fibras favorecen los mecanismos de cohesión interfibrillar que generan resistencia en el papel. Existe un efecto de biorefinado, respuesta que permite catalogar a la enzima Cel9B como "coadyuvante del refinado", su aplicación permite reducir la energía de refinado para conseguir determinadas propiedades de resistencia. En las pastas TCF la acción de Cel9B también genera cambios morfológicos en las fibras, verificando así su actuación sobre las fibras celulósicas. Para evaluar la posibilidad de un sinergismo entre celulasas que incremente el efecto individual de la enzima Cel9B en el refinado se estudia el sistema endo-exo entre endoglucanasas (Cel9B) y exoglucanasas (Cel48C); este posible efecto sinérgico se descarta ya que no se obtienen propiedades de resistencia superiores al efecto individual de la celulasa Cel9B.

La etapa de biorefinado con la enzima Cel9B permite identificar en su estructura modular [GH9-CBD3c- Fn3-CBD3b] el dominio responsable de la modificación superficial de las fibras. La aplicación de las celulasas recombinantes de Cel9B: dominio catalítico [GH9-CBD3c], dominios de unión a celulosa [Fn3- CBD3b] y [CBD3b] revelan que la mayor contribución del efecto de biorefinado se debe a la actuación del dominio catalítico [GH9-CBD3c], resultados innovadores que demuestran que la aplicación de esta celulasa recombinante produce resistencia en el papel con una mejor respuesta en la resistencia al desgarro en comparación a la enzima completa Cel9B.

Con respecto a la aplicación de la enzima lacasa de Trametes villosa junto con el mediador HBT -1- hidroxibenzotriazol- se encuentra que el sistema lacasa-mediador oxida la celulosa de las pastas blanqueadas (generación de grupos carbonilo) y modifica el contenido de los ácidos carboxílicos presentes en la pasta TCF, y a su vez las propiedades electrocinéticas; estos resultados se vinculan a la remoción parcial de los ácidos hexenurónicos [HexAs]. También se ha encontrado que el sistema lacasamediador no degrada la celulosa, por consiguiente su influencia en el refinado de la pasta TCF se considera positiva.

La remoción de los ácidos hexenurónicos con el sistema lacasa-mediador cobra especial interés al verificar su influencia en las determinaciones del número kappa y en la estabilidad de las propiedades ópticas; así el sistema lacasa-mediador reduce la reversión de la blancura por su efecto en la eliminación de los HexAs. El estudio de termoamarillamiento y fotoamarillamiento de la pasta TCF pone en evidencia la interferencia de los HexAs en la reversión de la blancura, siendo la aplicación del sistema lacasamediador una alternativa potencial para obtener papeles permanentes y resistentes. Además la remoción de HexAs modifica las propiedades de las pastas en la operación del refinado, un efecto muy importante se observa al aumentar la drenabilidad para un valor específico de resistencia manteniendo la energía requerida en el refinado.

The present thesis is placed within the frame of one of the lines of research of the Paper and Graphic Research Group (CIPAGRAF) -Department of Textile and Paper Engineering (DETIP), Technical University of Catalonia (UPC)-. The study is orientated to the Application of the Biotechnology in the Paper Manufacturing Processes. It deals with the application of biotechnological methods in the refining operation to promote the modification of the cellulose fibers by means of the utilization of enzymes. The goal is to get a stage of "biorefining" contributing to the decrease of the energy consumption - needed by the mechanical refining - and in the use of clean technologies that comply with the environmental laws.
In the research of new biotechnological techniques (enzymes) hydrolytic enzymes (cellulases) are used.

Also, due to the growing importance of oxidative enzymes (lacases), it is studied their influence on fibers, on refining and in the quality of paper.
The effects of these enzymes are evaluated in ECF and TCF kraft pulps of Eucalyptus globulus.
Biorefining depends of the efficacy of enzymes to enhance the refining process. At the same time the raw material highly influence the refining process. That is proved by the differences of refining behaviour shown by the ECF and TCF pulps.
The different severity of the production processes (pulping and bleaching) gives specific properties to the fiber, as they cause different alterations of their morphology. These alterations determine the refining aptitude of the pulps. The comparison of both types of pulps (ECF and TCF) allows to affirm that the sequence TCF causes major structural changes in the fibers and, as a consequence, a more rapid response is obtained in the refining operation.

The enzyme Cel9B (1,4- β endoglucanase) of Paenibacillus barcinonensis promotes a significant response in the refining of the ECF pulp, this fact is revealed by an increase of the primary and secondary refining effects. Phenomena like the higher hydration in the internal matrix of the fibers aids the mechanisms of interfibrillar cohesion that generate the mechanical resistance in the paper.
This biorefining effect allows to catalogue the enzyme Cel9B as a "refining helper" or "booster". Its application allows to reduce the refining energy and, also, to obtain certain strength properties.

In the TCF pulp the action of Cel9B also generates changes in the refined fibers.
To evaluate the possibility of a synergistic effect between cellulases that increase the individual effect of the enzyme Cel9B, the system endoglucanase (Cel9B) - exoglucanase (Cel48C) was studied. The possible synergistic effect was discarded since the strength properties attained are not higher than the individual effect of the cellulase Cel9B.

The biorefining stage with enzyme Cel9B allows to identify the responsible domain of the fibers modification in its modular structure [GH9-CBD3c-Fn3-CBD3b]. The application of recombinant cellulose Cel9B: catalytic domain [GH9-CBD3c], cellulose-binding domains [Fn3-CBD3b] and [CBD3b] shows that the greatest contribution of the biorefining effect is due to the performance of catalytic domain [GH9 - CBD3c]. These innovative results show that the application of this recombinant cellulase produces increases of paper resistance, specially in tear strength in comparison with the complete enzyme Cel9B.