Análisis de la respuesta de las levaduras a las condiciones de estrés osmótico y ausencia de nitrógeno durante la vinificación

Abstract

La fermentación alcohólica es un proceso complejo en el que los azúcares presentes en el mosto se convierten mayoritariamente en etanol y CO2 (Fleet and Heard, 1993), gracias a la acción de las levaduras, principalmente Saccharomyces cerevisiae. Durante la vinificación, las levaduras tienen que hacer frente a un conjunto de situaciones de estrés, de las que destacamos el estrés hiperosmótico al inicio del proceso, debido las elevadas concentraciones de azúcares en los mostos (150-250 g/L) (Attfiled, 1997), o el causado por el agotamiento de nutrientes, especialmente la depleción de nitrógeno. Existen diferentes trabajos en los que se estudia la respuesta de las levaduras a diferentes situaciones de estrés. En el llevado a cabo por Gasch et al. (2000) se describen alrededor de 900 genes que ven alterada su expresión cuando se exponen a diferentes tipos de estrés, lo que se denominó respuesta a estrés ambiental (ESR). Existen otros trabajos centrados en el proceso de la fermentación alcohólica, como el de Rossignol et al. (2003) donde se observó que más de 2000 genes variaban sus niveles durante la vinificación. En la primera parte se describe la respuesta de las levaduras al agotamiento de nitrógeno y la adición de diferentes fuentes. Se observa que la adición de estas fuentes a vinificaciones limitantes permite completar el proceso fermentativo de forma similar a la vinificación control, aunque la naturaleza de éstas sí influye, en el perfil organoléptico del producto final (Jiménez-Martí et al., 2007), como también influye en la reprogramación celular tras las adiciones (Jiménez-Martí et al., 2008). Asimismo, se han descrito posibles marcadores moleculares de la limitación de nitrógeno como la actividad arginasa o los niveles de expresión del gen ACA1 (Jiménez-Martí et al., 2007). En la segunda parte se estudia la respuesta de las levaduras al estrés hiperosmótico causado por elevadas concentraciones de glucosa. Se deduce que hay una mayor represión por catabolito de carbono en 20% de glucosa que en 2%. Se analizó también la implicación de algunas de las principales rutas de señalización en respuesta a este tipo particular de estrés; observándose la implicación de la ruta HOG y también una cierta participación de las rutas PKA y TOR. Se identificaró un grupo de genes de función desconocida más expresados en 20% de glucosa que en 2%. Uno de ellos es YHR087W, cuyo mutante de deleción muestra defectos de crecimiento y consumo de glucosa en medios conteniendo elevadas concentraciones de glucosa, además de presentar mayor susceptibilidad a otras condiciones de estrés que su cepa parental, por lo que se considera un gen de respuesta a estrés. Estudios proteómicos comparativos entre dicho mutante y su cepa parental en medios con 20% de glucosa muestran cambios en los niveles de expresión de proteínas pertenecientes a la categoría de plegamiento de proteínas. También se realizó un estudio transcriptómico global comparativo entre una cepa vínica y de laboratorio frente a elevadas concentraciones de azúcares. Los resultados sugieren que la mayor viabilidad de la vínica en estos medios podría estar relacionada con una mayor expresión de los genes implicados en glicolisis, fermentación y procesos biosintéticos. Finalmente, se llevaron a cabo diferentes aproximaciones con la intención de mejorar el comportamiento fermentativo de algunas cepas vínicas. Esto se consiguió, por un lado con la preadaptación de cepas con problemas al inicio de la fermentación en medios de rehidratación con determinadas concentraciones de glucosa. Por otro lado, se realizaron manipulaciones genéticas de los genes HSP26 e YHR087W. Éstas resultan, en general, en un aumento de los niveles de expresión de los genes, y en algunos casos en una mayor resistencia a diferentes condiciones de estrés, así como un menor tiempo para finalizar la fermentación (Jiménez-Martí et al., 2009).

Alcoholic fermentation is a complex process in which sugars presents in grape must become ethanol and CO2 through the action of yeasts, especially Saccharomyces cerevisiae. Throughout wine production yeast cells are affected by a plethora of stress conditions, such as nitrogen starvation, or osmotic stress due to high glucose concentrations. In this work we analyzed the effect of adding different nitrogen sources (ammonia, amino acids or a combination of both) under nitrogen depletion condtions in order to understand yeast metabolic changes. We found that the nature of the nitrogen source added introduces changes to the volatile compounds profile and to the gene expression, and also there is a differential cellular reprogramming after addition depending on the nitrogen source. On the other hand, arginase activity and the expression of ACA1 gene are useful as a molecular markers of nitrogen depletion/addition during vinification. Besides, we present a comprehensive study of the response to high glucose stress which indicates important transcriptomic changes, especially in terms of the genes involved in both stress response and respiration, and the implication of the HOG pathway. We also describe several genes of an unknown function highly expressed under 20% (w/v) glucose than under 2% . In this work we focus on the YHR087W gene, whose relevance for the response to high sugar and other stress conditions and the relationship of the encoded protein with several Hsp proteins suggest its implication in stress response. Indeed, we introduce several genetic manipulations in HSP26 and YHR087W in two different wine yeasts in order to improve their fermentative behavior. Our results indicate that some of these modifications result in strains with higher expression of these genes, better resistance to certain stress conditions, and even improved fermentative behavior. We also compare several laboratory and wine yeast strains in terms of their ability to start growth in must. We propose several clues for yeast strains to adapt to the wine production conditions: the high expression of genes involved in both biosynthetic processes and glycerol biosynthesis and content. Moreover, we demonstrate the usefulness of pre-adaptation of wine yeast with problems at the beginning of the process introducing a certain percentage of glucose in the rehydratation media.