Engineering ultrasensivity and differential diffusion to build spatial patterns in a 3D mammalian cell culture system

Abstract

Engineering self-organised spatial patterns based on reaction-diffusion models can be the stepping stone for tissue engineering. Previous reports based on both theoretical and experimental studies have implied the importance of ultrasensitivity and differential diffusion as key requirements for building self-organised spatial patterns on mammalian cells with extracellular signalling systems. In the sender-receiver system developed by our team using Madin-Darby canine kidney (MDCK) cysts and hepatocyte growth factor (HGF) signalling, I have explored the sensitivity of different genes to varying doses of HGF to find ultrasensitive regulatory functions. I have successfully found 12 candidate genes, the regulatory function of which can be used for downstream engineering. I have also developed a fusion protein of HGF, fused to Streptavidin (HGF-SA), that has an apparent 90 times slower diffusion rate in collagen type I extracellular matrix compared to HGF. These well characterised parts can be used to form combined positive and negative feedback loops. Integration and expression of this gene regulatory network in the MDCK genome, using modern genome engineering tools, can potentially allow MDCK cysts to communicate with each other and to form self-organised periodic patterns. These are predicted to have wavelengths of approximately 6 mm, on a field of about 1000 randomly distributed cysts, over a period of 5 days. This study extends our knowledge of the spatiotemporal control of growth and development of MDCK cysts and hence could lead to extending our ability in engineering tissues.

La ingeniería de patrones espaciales auto-organizados basados en modelos de reacción-difusión puede ser el trampolín para la ingeniería de tejidos. Informes anteriores basados en estudios teóricos y experimentales han implicado la importancia de la ultrasensibilidad y la difusión diferencial como requisitos clave para la construcción de patrones espaciales auto-organizados en las células de mamíferos con sistemas de señalización extracelular. En el sistema receptor remitente que hemos desarrollado utilizando quistes de riñones caninos Madin-Darby (MDCK) y la señalización por factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), he explorado la sensibilidad de diferentes genes a diferentes dosis de HGF para encontrar funciones reguladoras ultrasensibles. Con este análisis, he encontrado con éxito 12 genes candidatos, cuya función reguladora se puede utilizar en posteriores procesos de ingeniería. También he explorado distintas fusiones de proteína con HGF y he encontrado que el mejor candidato es la fusión con Streptavidina (HGF-SA). Esta proteína de fusión tiene una tasa de difusión aparente, en la matriz extracelular de colágeno tipo I, 90 veces más lenta en comparación con el HGF. Estas partes bien caracterizadas pueden usarse para formar bucles de retroalimentación positivos y negativos combinados. La integración y expresión de esta red reguladora de genes en el genoma MDCK, utilizando las herramientas modernas de ingeniería de genoma, potencialmente puede permitir que los quistes MDCK se comuniquen entre sí y formen patrones periódicos auto-organizados. Se predice que tienen longitudes de onda de aproximadamente 6 mm, en un campo de aproximadamente 1000 quistes distribuidos aleatoriamente, durante un periodo de 5 días. Este estudio extiende nuestro conocimiento del control espacio-temporal del crecimiento y desarrollo de los quistes MDCK y, por lo tanto, podría contribuir en la mejora de la ingeniería de tejidos.