Estudio para la validación de los biomarcadores de elección que reflejen la respuesta individual de los pacientes trasplantados de órganos sólidos al tratamiento inmunosupresor

Author

Boix Giner, Francisco José

Director

Muro Amador, Manuel

Álvarez López, Mª del Rocío

Tutor

Aparicio Alonso, Pedro

Date of defense

2017-06-23

Pages

478 p.



Department/Institute

Universidad de Murcia. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular B e Inmunología

Abstract

Hoy en día, el trasplante de órganos sólidos es una opción terapéutica ampliamente utilizada para el tratamiento de múltiples enfermedades. A pesar de los avances en el campo del trasplante de órganos sólidos, la supervivencia tanto del paciente como del injerto a largo plazo se ve comprometida debido al uso de tratamiento inmunosupresor. Es por ello que es necesario profundizar en el estudio de biomarcadores del sistema inmunitario que reflejen el efecto farmacodinámico del inmunosupresor y que por tanto ayuden a mejorar la respuesta individual del paciente al fármaco y así ajustar la dosis de forma individualizada. El objetivo principal del presente trabajo de tesis doctoral consiste en la selección, estandarización y validación de los biomarcadores más óptimos del efecto farmacodinámico y farmacocinético que reflejen la respuesta individual al tratamiento inmunosupresor y que puedan ser predictivos de la evolución clínica (rechazo agudo, infección oportunista, toxicidad, entre otros) en pacientes sometidos a distintos tipos de trasplante. Los objetivos propios del presente trabajo son: 1. Monitorizar y evaluar la expresión de moléculas de superficie linfocitaria como CD25, CD38, CD69, CD95 y CD154 junto con moléculas típicas de las células Treg como CD4, CD25, CD27, CD127, FoxP3 y observar la expresión de las moléculas CD62L y CD45RO, por citometría de flujo. 2. Cuantificar y monitorizar el número de moléculas CD28 en cifras absolutas en la membrana celular de linfocitos T CD4+ de sangre periférica de trasplantados hepáticos y renales, para discriminar el rechazo agudo del injerto, la posibilidad de sufrir infecciones oportunistas y/o recidivas del virus de hepatitis C mediante citometría de flujo. 3. Monitorizar y evaluar la capacidad productiva y secretora de citoquinas (IL-2, IFNγ, IL-17, IL-10 y TGFβ) in vitro y cuantificar su presencia intracitoplasmática y en sobrenadante de cultivo por citometría de flujo y ELISA. 4. Simplificar y unificar las metodologías para facilitar su posterior aplicación en la monitorización del receptor de aloinjerto en la rutina del laboratorio clínico de inmunología del trasplante. Los trasplantados hepáticos y renales que desarrollaron rechazo agudo presentaron niveles incrementados de IL-2, IL-17 e IFNγ. Del mismo modo, presentaron cifras disminuidas de linfocitos aTreg y linfocitos nTreg, así como diferencias en la expresión de CD28, CD38, CD95 y CD154 en linfocitos T CD4+ y CD8+. Dichas diferencias en los biomarcadores pudieron utilizarse para monitorizar a los pacientes trasplantados y estratificar el riesgo de desarrollo de rechazo agudo. Los trasplantados hepáticos y renales con niveles pre-trasplante reducidos de IL-10 e IFNγ presentaban mayor susceptibilidad a infecciones oportunistas. Durante el periodo post-trasplante, IFNγ se mantuvo disminuido, mientras que IL-17, TGFβ e IL-10 experimentaron un incremento asociado con la aparición de la infección oportunista. De igual modo, niveles de linfocitos nTreg y aTreg elevados en trasplantados hepáticos y renales se asociaron con desarrollo de infección oportunista. Igualmente, niveles pre-trasplante elevados de CD25 y CD69 en linfocitos T CD8+ y CD28 en linfocitos T CD4+ se correlacionaron con la aparición de infección oportunista. Por último, los trasplantados hepáticos con recidiva por virus de hepatitis C presentaron una mayor capacidad de síntesis y secreción de IL-17 en situación pre-trasplante que se mantuvo incrementada durante el primer año post-trasplante. También presentaron cifras pre- y post-trasplante incrementadas de linfocitos T CD8+CD154+. Del mismo modo, los niveles post-trasplante incrementados de linfocitos aTreg y nTreg fueron utilizados para la estratificación del riesgo de recidiva de virus C en receptores hepáticos.


Nowadays, solid organ transplantation is an available therapeutically option to treat several different diseases. Despite the achievements over recent years, patient as well as graft survival rates can be compromised due to the exposition from the patient to a chronical immunosuppressive regimen. In fact, the search for new biomarkers is needed in order to better understand the pharmacodynamics effect of the immunosuppressive therapy in order for the clinicians to be able to individually adjust the dose of the drug. The main objective herein presented in this work is to standardise and validate the most optimal biomarkers that better show the pharmacodynamics and pharmacokinetics effect in the individual response to the treatment. Besides, these biomarkers must be capable to predict the clinical outcome, such as acute rejection, opportunistic infection, nephrotoxicity, etc…) in those patients undergoing to a solid organ transplant. The different objectives are as follows: 1. To monitor and assess the expression of different surface lymphocyte antigens, such as CD25, CD38, CD69, CD95 and CD154 as well as the typical markers of Treg lymphocytes like CD4, CD25, CD27, CD127, FoxP3, CD62L and CD45RO by flow cytometry. 2. To quantify and monitor the absolute number of CD28 molecules on the surface of peripheral blood CD4+ T lymphocytes from liver and kidney transplant recipients to assess the risk of acute rejection, opportunistic infection and hepatitis C virus recurrence by flow cytometry. 3. To monitor and assess the in vitro production and release capacity of different cytokines (IL-2, IFNγ, IL-17, IL-10 and TGFβ) and quantify its intracellular as well as soluble concentration in culture supernatant by flow cytometry and ELISA. 4. Simplify and standardise the methodology for its application in the post-transplant monitoring of recipients in histocompatibility laboratories in a clinical setting. Liver and kidney transplant recipients who developed acute rejection showed high levels of IL-2, IL-17 and IFNγ. Furthermore, this population also showed low percentages of aTreg and nTreg lymphocytes as well as differences in the expression of CD28, CD38, CD95 and CD154 on cultured CD4+ and CD8+ T lymphocytes. Such differences in the expression for these biomarkers could be used to monitor transplant recipients during the post-transplant period and helped to stratify the risk of suffering acute rejection. Liver and kidney transplant recipients with reduced pre-transplant level of IL-10 and IFNγ displayed higher susceptibility of developing opportunistic infection. Within the post-transplant monitoring period, IFNγ remained decreased, whereas IL-17, TGFβ and IL-10 exhibited an increased associated with the occurrence of opportunistic infection. Similarly, high levels of nTreg and aTreg lymphocytes in liver and kidney transplant recipients were correlated with opportunistic infection. Furthermore, higher pre-transplant levels of CD25 and CD69 on CD8+ T lymphocytes as well as CD28 on CD4+ T lymphocytes were associated with the occurrence of opportunistic infection. These biomarkers can be utilised to monitor and predict the recurrence of post-transplant opportunistic infection and could help to individualise the prophylaxis treatment. Finally, liver transplant recipients with hepatitis C virus recurrence showed a higher intracellular cytokine production and cytokine release capabilities of IL-17 at baseline that remained increased within the first year post-transplantation. On the other hand, this population also showed a pre- and post-transplant high level of CD8+CD154+ T lymphocytes. Furthermore, increased levels of aTreg and nTreg lymphocytes were shown to be able to stratify patients at high risk of hepatitis C virus recurrence. The use of these biomarkers could help clinicians to monitor liver transplant recipients at high risk of hepatic cirrhosis due to C virus recurrence.

Keywords

Trasplante de órganos; tejidos

Subjects

6 - Applied Sciences. Medicine. Technology; 61 - Medical sciences; 616 - Pathology. Clinical medicine

Knowledge Area

Ciencias de la Salud

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