Aplicació de tècniques de seqüenciació massiva a l´estudi de virus potencialment contaminants d´aigües i/o aliments

Abstract

L’objectiu global plantejat en aquesta tesi ha estat l’anàlisi dels patògens virals que a través de l’aigua residual, poden contaminar l’aigua de reg i els aliments. Les aigües regenerades i les aigües de riu són importants fonts de reg i per tant, una possible via d’entrada de patògens a la cadena alimentària. En un primer capítol, la tesi doctoral s’ha centrat en l’avaluació de la qualitat microbiològica de l’aigua regenerada produïda en un sistema de llacunatge mitjançant l’estudi de la reducció de les concentracions de múltiples patògens, posant èmfasi en l’estudi de virus indicadors de contaminació fecal humana (adenovirus humans i poliomavirus JC) i patògens estretament relacionats amb el consum d’aigua i aliments contaminats (norovirus humans i hepatitis E). De forma paral·lela s’ha estudiat també la reducció dels indicadors bacterians de contaminació fecal (E.coli i enterococs fecals) inclosos en la legislació d’aigües regenerades. Conèixer el viroma present a l’aigua residual pot oferir informació important des d’una perspectiva ecològica, però també de salut pública, ja que un dels principals inputs de l’aigua residual urbana són els virus excretats per la població a partir de les seves femtes, orina o descamació epitelial. Les tècniques de seqüenciació massiva aplicades a l’estudi de virus permeten, sota un únic anàlisi, conèixer totes les espècies víriques presents en una mostra. En la present tesi s’ha avaluat l’efecte que tenen en la composició de les poblacions virals diferents mètodes de concentració i extracció d’àcids nucleics, utilitzant com a matriu l’aigua residual urbana. Amb la finalitat de caracteritzar els riscos virològics associats a l’aigua residual i a la producció d’aigües regenerades, s’ha desenvolupat un protocol eficient per a l’estudi del viroma. La contribució de l’orina en el viroma de l’aigua residual demostra que el nombre de virus excretats per orina queda restringit majoritàriament a famílies de virus ADN: Polyomaviridae i Papillomaviridae. Les tècniques de metagenòmica de virus permeten l’estudi del viroma de l’aigua residual, caracteritzant simultàniament sota un únic assaig, les diferents famílies víriques presents en aquestes matrius. Com a resultat de la tesi s’han pogut detectar importants patògens humans de les famílies Caliciviridae, Picornaviridae, Adenoviridae, Polyomaviridae, Papillomaviridae, Picobirnaviridae, Circoviridae, Anelloviridae, Parvoviridae, Hepeviridae i Astroviridae. En el quart capítol de la tesi, s’ha avaluat el potencial que tenen les tècniques de seqüenciació massiva com a eina de monitorització en el camp de la seguretat alimentària. Amb aquesta finalitat, s’han analitzat els virus presents tant a la superfície dels vegetals (juliverts) com en l’aigua de reg (aigua del riu Besòs, amb un cabal principalment generat pels efluents secundaris de les EDAR de la conca). En total s’han detectat 18 famílies víriques diferents de la superfície del julivert incloent membres de les famílies Astroviridae, Caliciviridae, Hepeviridae, Picornaviridae i Parvoviridae. A la mateixa aigua de riu s’han detectat 26 famílies víriques diferents incloent patògens vírics com adenovirus, rotavirus, astrovirus o picornavirus.

The overall objective of the present thesis has been to analyze the viral pathogens that can be transmitted through contaminated water or food. Reclaimed and river water are important irrigation sources. Therefore, these water matrices can represent an important entrance of pathogens into the food chain. The first chapter of the present thesis has focused in the evaluation of the microbiological quality of reclaimed water produced in a lagoon system by studying the concentration reduction of multiple pathogens including human adenoviruses, noroviruses, polyomaviruses and hepatitis E virus. The reduction of fecal indicator bacteria, included in the reclaimed water legislations, has been studied simultaneously. The effect of the concentration and extraction methods on the viral community composition has been evaluated in urban sewage. A sensitive protocol has been developed to characterize the different pathogenic viruses that can be present in these water matrices, representing a potential threat if contamination of water or food occurs. These methodologies have allowed the identification of important viral pathogens from Caliciviridae, Picornaviridae, Adenoviridae, Polyomaviridae, Papillomaviridae, Picobirnaviridae, Circoviridae, Anelloviridae, Parvoviridae, Hepeviridae and Astroviridae families. The contribution of urine to the metavirome of urban sewage is restricted, mainly, to double strand DNA viruses from Polyomaviridae and Papillomaviridae families. Finally, the applicability of next generation sequencing as a surveillance tool for food safety porpoises has been evaluated by using fecally contaminated river water to irrigate fresh vegetables. River water contained 26 different viral families including important pathogens such as adenoviruses, rotaviruses, astroviruses and picornaviruses. At the surface of irrigated vegetables other important human viral pathogens from 18 different viral families, including Astroviridae, Caliciviridae, Hepeviridae, Picornaviridae and Parvoviridae were detected.