New insights into the skin and its mucus in teleost fish = Nuevas perspectivas en el estudio de la piel y el moco de peces teleósteos

Abstract

En la presente Tesis Doctoral hemos estudiado la piel y el moco de teleósteos con especial énfasis en la inmunidad de dorada y de lubina. Concretamente, nos hemos centrado en la caracterización de la piel con diferenciación dorso-ventral, la respuesta inmune contra el principal virus en dorada (linfocistis), las condiciones óptimas de almacenamiento de moco para evaluar las actividades inmunes humorales, incluyendo la congelación (a -20ºC ó a -80ºC) y la liofilización, y comparando con moco fresco; así como también en la caracterización del mapa proteómico del moco de lubina y los cambios producidos por la administración del probiótico Shewanella putrefaciens Pdp11, el estrés por hacinamiento y las variaciones producidas por heridas crónicas. Para este propósito, hemos desarrollado estudios de histología para analizar las piel a nivel óptico (incluyendo tinciones con hematoxilina-eosina, PAS y tricrómico de Mallory), y a nivel electrónico cuantificando por análisis de imagen las regiones dorsal y ventral, desarrollando un protocolo para aislar células de la piel en ambas regiones, así como viendo el perfil de expresión génica de nueve citoquinas (il1b, tnfa, il6, il7, il8, il15, il18, il10 y tgfb) en ambas regiones y los cambios frente al patógeno Photobacterium damselae ssp. piscicida, y el probiótico Pdp11. En el brote natural de linfocistis, la replicación del virus se estudió la replicación del virus por PCR anillada, la respuesta humoral (IgM, complemento y peroxidasa en suero), la respuesta humoral contra el virus fue estudiada a través de los niveles de IgM, el complemento y la peroxidasa en suero, la respuesta celular a través peroxidasa y explosión respiratoria en leucocitos de riñón cefálico, y la expresión de marcadores inmunes como ifn, irf3, mx, mhc2a, csf1r, ighm, tcra, hamp, il1b y nccrp1. Para estudiar las variaciones en la inmunidad humoral debido al almacenamiento del moco hemos evaluado proteínas totales, unión de lectinas a azúcares terminales, IgM, peroxidasa, lisozima, proteasa, antiproteasa, esterasa y fosfatasa alcalina, que son las principales actividades humorales que se evalúan habitualmente bajo distintos retos. Para estudiar los proteomas, realizamos la purificación de las proteínas de moco, separación de estas proteínas en 2-D usando la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) e identificando esas proteínas luego a través de cromatografía líquida acoplada a espectrofotometría masas en tándem (LC-MS/MS). Finalmente, para el análisis bioinformático de los datos generados se utilizó el servidor MASCOT aprovechando las bases de datos de NCBI y SwissProt. En el caso de los proteomas diferenciales, se utilizó el programa PDQuest Advanced para detectar los spots diferencialmente expresados en los geles de dos dimensiones. Como resultados, en primer lugar la microscopía óptica y electrónica reveló una mayor superficie celular y área de microcrestas en la región dorsal, pero mayor grosor epidérmico y niveles de apoptosis en la región ventral. Además, el perfil de expresión de citoquinas no se alteró por la exposición al patógeno o al probiótico en la región dorsal pero se alteró fuertemente en la región ventral. Por otro lado, el linfocistis, cuya replicación fue demostrada solo en el grupo infectado, provocó un descenso de la inmunidad adaptiva, y un incremento de la inmunidad citotóxica innata en el lugar de la infección. Respecto al moco de dorada, el almacenamiento por congelación o por liofilización disminuyó los niveles de unión de lectinas a azúcares terminales, y la lisozima y la proteasa, demostrando que la liofilización es el método menos recomendado ya que alteró los niveles de la mayoría de los parámetros, excepto IgM, antiproteasa y esterasa. A nivel proteómico, establecimos el primer mapa proteómico de lubina, contribuyendo a establecer marcadores de bienestar, muchos de ellos asociados a la inmunidad de la mucosa, necesario para un mejor entendimiento de las propiedades del moco en peces. Finalmente, la administración de Pdp11 incrementó los niveles de varias proteínas relativas al inmunitario, mejorando la inmunidad de la mucosa; mientras que las proteínas identificadas en el moco después de heridas crónicas disminuyeron en los niveles en todos los casos, aumentando por tanto la susceptibilidad a infecciones.

During the present Doctoral Thesis, we have studied the skin and its mucus with special emphasis on the immunity of gilthead seabream and European sea bass. Concretely, we have focused on the skin characterization with dorso-ventral differentiation, the immune response against the main virus in gilthead seabream (linfocistis), the optimal conditions of skin mucus storage to assess humoral immune activities, including freezing (at -20ºC and at -80ºC) and lyophilization and comparing with fresh mucus, as well as the proteome map of skin mucus from European sea bass and the changes in the skin mucus proteome of gilthead seabream due to probiotic Shewanella putrefaciens Pdp11 intake, crowding stress and the variations produced by chronic wounds. For this purpose, we have developed studies of histology to analyse the skin cells at optical level (including several stains such as haematoxylin-eosin, PAS or Mallory’s trichrome) and at electronic level, quantifying by image analysis the dorsal and ventral regions, developing a protocol to isolate the skin cells of both regions, as well as studying the expression profile of nine cytokines (il1b, tnfa, il6, il7, il8, il15, il18 and tgfb) in both regions and their changes produced by the pathogen Photobacterium damseale ssp. piscicida and the probiotic Pdp11. In the natural outbreak of lymphocystis, its replication was studied by nested PCR, the immune response against the virus was studied evaluating the humoral activities such as total IgM levels, complement and peroxidase in serum, and cellular activities such as respiratory burst and peroxidase in head-kidney leucocytes, and the gene expression of immune-related markers such as ifn, irf3, mx, mhc2a, csfr1, ighm, tcra, hamp, il1b and nccrp1. For studying the variations produced in the humoral immunity from the stored skin mucus, we have evaluated total protein levels, lectin-biding levels, total IgM levels, peroxidase, lysozyme, protease, antiprotease, esterase and alkaline phosphatase, all which are the most evaluated activities under different challenges. For studying the proteomes, we have purified the skin mucus proteins, separating the protein complex by isoelectric point and molecular mass through 2-D SDS-PAGE, and identifying the peptides by LC-MS/MS. Finally, the bioinformatic analysis was performed by MASCOT server using the NCBI and SwissProt databases. In the case differential proteomes, PDQuest Advanced software was used to detect the differentially expressed spots in the 2-D gels. As results, first optical and electron microscopic analysis revealed higher cell surface and area of microridges in the dorsal region, but higher epidermal thickness and apoptosis cell death in the ventral region. In addition, the cytokine expression profile was unaltered by the pathogen and the probiotic in the dorsal regions but greatly altered in the ventral region. On the other hand, lymphocystis, whose replication was exclusively demonstrated in the infected, provoked a decrease of adaptive immunity, mainly IgM levels in serum and the adaptive immune markers in skin and head-kidney, and an increase of cytotoxic innate immunity at the site of the infection. Regarding to skin mucus of gilthead seabream, the storage by freezing or by lyophilization decreased the lectin-binding levels, and the lysozyme and protease activity. Our study demonstrated that lyophilization is the less recommended storage method since only three activities were unaltered when compared to fresh mucus: IgM, antiprotease and esterase. At proteomic level, we have established the first proteome map of European sea bass, helping to establish the welfare markers, many of them associated with the mucosal immunity, needed to a better understanding of the fish skin mucus properties. Finally, Pdp11 intake increased the levels of several immune-related proteins, improving the mucosal immunity; whilst all the identified proteins were under-expressed after chronic wounds, increasing the susceptibility to any infection.