Urolithins, pomegranate ellagitannin microbial metabolites, as potential modulators of cell and molecular events associated with colorectal cancer: in vitro vs.: human studies= Potencial de las urolitinas, metabolitos microbianos derivados de los elagitaninos de la granada, como moduladores de procesos celulares y moleculares asociados a cáncer colorrectal: in vitro vs.: estudios en humanos

Abstract

El principal objetivo de esta Tesis fue evaluar los potenciales efectos anticancerígenos del consumo de un extracto de granada (EG) en pacientes con cáncer colorrectal (CCR), así como investigar los cambios moleculares asociados a esos efectos tanto in vitro como en humanos. Se investigó: i) el perfil metabólico de los polifenoles de la granada y sus derivados metabólicos en tejidos de colon, sangre y orina obtenidos de pacientes con CCR tras el consumo de dos EGs; ii) los cambios producidos en diversos marcadores moleculares en tejidos de colon tras consumo de EGs; iii) los efectos ejercidos por las urolitinas, así como el papel del metabolismo de Fase II y la relación estructura-actividad de las urolitinas; iv) los efectos anti-proliferativos del ácido elágico (EA) y urolitinas contra el CCR, y los mecanismos moleculares asociados; y v) explorar la actividad anticancerígena de estos compuestos en un modelo de células tipo madre de CCR. Nuestros resultados permitieron describir por primera vez concentraciones significativas de ácido gálico, derivados del EA y hasta 12 urolitinas distintas en tejido colónico (también algunos de ellos en plasma y orina) de pacientes con CCR tras el consumo de EG. Se observaron mayores niveles de estos metabolitos en el tejido sano que en el tumoral. También, se pudo clasificar a los pacientes en tres metabotipos según las urolitinas detectadas: metabotipo A (pacientes que solo producían urolitina A como metabolito final), metabotipo B (además de urolitina A, se detectaba isourolitina A y/o urolitina B) y metabotipo 0 (no productores de urolitinas). Además, describimos por primera vez diferencias significativas en la expresión de determinados marcadores moleculares (microRNAs (miRs) y genes) entre los tejidos sanos y malignos, e identificamos la gran influencia del protocolo experimental, especialmente la cirugía, en la expresión de dichos marcadores; algo bastante subestimado y que puede llevar a error en la propuesta de marcadores de CCR. A pesar de esta influencia y de la variabilidad inter-individual en la expresión de los marcadores estudiados, se observó cierta modulación en varios miRs y genes de pacientes que consumieron los EG, lo que sugiere un posible efecto asociado a si ingesta. Así mismo, se evaluaron los efectos ejercidos por las urolitinas mediante estudios in vitro empleando diferentes modelos celulares de colon, tanto comerciales (células normales y cancerosas) como en cultivos primarios con fenotipo de célula madre aisladas de un paciente. Los resultados mostraron que: i) las urolitinas ejercen diferentes efectos anti-proliferativos dependiendo de la urolitina y la línea celular empleada; ii) los transportadores ABC y el metabolismo de Fase II son mecanismos de resistencia contra las urolitinas; iii) las urolitinas glucurónidos ejercen un efecto antiproliferativo menor que sus equivalentes agliconas; y iv) diferentes mezclas de metabolitos ejercían efectos antiproliferativos similares e inducían el bloqueo del ciclo celular y apoptosis. Además, determinamos cambios relevantes en marcadores clave de cáncer, incluida la inducción de CDKN1A (p21) como mecanismo común de las urolitinas en su actividad anticancerígena. Por último, en el estudio con células de CCR con fenotipo de células madre describimos el efecto de dos mezclas de urolitinas, siendo la mezcla representativa del metabotipo A más eficaz que la del metabotipo B. Los estudios realizados en esta Tesis han permitido caracterizar el perfil metabólico de las urolitinas en tejido colónico de pacientes con CCR, así como describir cambios en marcadores moleculares (miRs y genes específicos relacionados con el CCR) asociados al consumo de EG. Los ensayos in vitro permitieron profundizar en los mecanismos implicados en los efectos anticancerígenos ejercidos por las urolitinas y EA, tanto de manera individual como en mezclas que representan los diferentes metabotipos y a concentraciones fisiológicamente relevantes.

The principal aim of this Thesis was to investigate the potential anti-cancer effects of pomegranate extracts (PEs) containing ellagitannins and ellagic acid (EA) in colorectal cancer (CRC) patients, and to further clarify the molecular changes that may underlie these effects by in vitro studies. In these works we studied: i) the metabolic profiling of pomegranate phenolics and derived metabolites in colon tissue samples, blood and urine from CRC patients after the intake of PEs; ii) the potential molecular changes in these colonic tissues associated with the intake of PEs; iii) the effects of urolithins against CRC as well as the role of Phase-II metabolism and the structure-activity relationship of urolithins; iv) the anti-proliferative effects and molecular mechanisms associated with the response to EA and urolitinas against CRC; and v) to explore new potentialities of these compounds to battle CRC using a CRC stem cell model. Our results showed for the first time the presence of significant levels of EA derivatives and urolithins in colon tissues from CRC patients after the consumption of PE as well as the presence of these metabolites in plasma and urine. Individual and total metabolites levels were higher in normal than in malignant colon tissues. Furthermore, patients could be classified into three metabotypes according to the urolithins detected: metabotype A (only Uro-A is produced as final urolithin), metabotype B (in addition to Uro-A, also IsoUro-A and/or Uro-B are specifically produced in this metabotype), and metabotype 0 (urolithin non-producers). These studies were critical to design more reliable in vitro studies. Next, we described significant differences in the expression of specific molecular markers (microRNAs (miRs) and specific genes) between healthy and malignant tissues, and the critical influence of the experimental protocol, mostly the surgical procedure, in the expression of these markers. However, despite the influence of the experimental procedures and the inter-individual variability in the expression of the molecular markers studied, we discriminated a moderate modulation of several miRs and specific genes in patients who consumed the PEs suggesting a potential effect associated with their intake. In addition, the effects of urolithins were evaluated in in vitro studies using different commercial colon cell lines (normal and malignant) and primary cultures with stem cell-like phenotype isolated from a CRC patient. These results showed that: i) urolithins exerted different anti-proliferative effects depending on the urolithin and the cell line used; ii) the role of ABC transporters and Phase II metabolism as mechanisms of cancer resistance against urolithins; iii) urolithin glucuronides exerted lower effect then their aglycone counterparts; and iv) the two mixtures of urolithins and EA, resembling the human urolithin metabotypes, exerted similar anti-proliferative effects and induced cell cycle arrest and apoptosis. Furthermore, we described significant changes in key cancer markers and corroborated that CDKN1A (p21) induction is a common mechanism underlying the anticancer effect of urolithins. Finally, we carried out a study with colorectal CSC where the effect of the two mixtures mimicking both metabotypes A and B were evaluated. Herein, we reported that metabotype A exerted higher anticancer properties (lower number and size of colonospheres and lower expression of the cancer chemoresistant marker ALDH) than metabotype B in this cell model. The studies included in this Thesis allowed us to describe the metabolic profiling of urolithins in colon tissue of patients with CRC and to describe changes in molecular markers (miRs and specific genes related to CRC) associated with the intake of PEs. The in vitro studies allowed to deepen into the mechanisms involved in the anti-cancer effects exerted by the urolithins and EA, both individually and in mixtures representative of different human metabotypes.