Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-07-2015
Retinal neurogenesis starts with RGC differentiation, RGC can be categorized in different types according to their morphology, physiology, molecular characteristics or projection laterality. Conforming to the latter characteristic mouse RGCs can be
divided into: contralateral projecting RGCs (cRGC), which express Islet2 and Shh both important for their differentiation process; and ipsilateral projecting RGCs (iRGCs), which express Zic2 and the Shh receptor, Boc. As they differentiate, RGCs extend an axon that grows along the visual pathway, guided by axon guidance molecules,
including, for example, Sfrp1. Indeed, Sfrp1 has been implicated in the reorientation of RGC growth cones in both Xenopus and chick.
In this thesis, we asked if Boc plays a role in the specification of mouse iRGCs and if this activity is related with Shh signalling. We also analysed whether and how Sfrp1/2 contribute to the correct growth and guidance of mouse RGCs. Analysis of Boc mutants showed a reduction of Zic2-positive iRGCs cells and an increase in Islet2/Shhpositive cRGCs into the VT region. This shift in the proportion of RGC types alters the projection pattern to the dLGN. This change in RGC specification results from the alteration of a feedback regulatory loop between Zic2 and Shh signalling, as demonstrated by in utero electroporation experiments. Overexpression of Shh in the
VT region reduced Zic2 expression; on the contrary, ectopic Zic2 expression into the central retina decreased Shh levels. On the other hand, genetic inactivation of Sfrp1/2 causes intraretinal axon guidance defects and defasciculation of the RGC axons as they grow along the visual pathway. The defasciculation defects are likely a
consequence of an increase in ADAM10 activity, which is negatively regulated by Sfrps. Indeed, retinal explants from Sfrp1/2 null mice grow neuritis with a dishevelled appearance; this defect is reversed by the addion of a specific ADAM10 inhibitor. These observations are associated with an increase in L1 and N-cadherin processing
in the visual pathway of Sfrp1/2 mutants and in explants overexpressing ADAM10. Based on these results, we propose that Boc negatively modulates Shh signalling in VT region of the retina, allowing Zic2 expression. This regulation in turns controls the
generation of the correct number of iRGC. Our results also indicate that Sfrp1/2 are implicated in RGC axon guidance by a direct and indirect mechanisms.
La neurogénesis en la retina comienza con la diferenciación de las CGR. Las
CGR pueden clasificarse en diferentes tipos dependiendo de su morfología, fisiología,
características moleculares o lateralidad de sus proyecciones. Respecto a esta última
característica, las CGR de ratón se dividen en: CGR que proyectan contralateralmente
(CGRc), las cuales expresan Shh e Islet2 ambos importantes en su proceso de
diferenciación; y las CGR que proyectan ipsilateralmente (CGRi), las cuales expresan
Zic2 y el receptor de Shh, Boc. Cuando las CGR se han diferenciado extienden un
axón que crece a lo largo de la vía visual, este axón es guiado por moléculas de guía
axonal, las cuales incluyen a Sfrp1. Sfrp1 ha sido implicado en la reorientación de los
conos de crecimiento de las CGR en Xenopus y pollo.
En esta tesis, nos hemos preguntado si Boc juega un papel en la
especificación de las CGRi en ratón, y si su actividad está relacionada con la
señalización de Shh. También hemos analizado si Sfrp1/2 contribuyen al correcto
crecimiento y guía de los axones de las CGR en ratón, y en caso de ser así, cual es el
mecanismo. El análisis de los mutantes de Boc muestran una reducción de las CGRi
Zic2 positivas y un incremento de las CGRc Islet2/Shh positivas dentro de la región
VT. Este cambio en la proporción de los tipos de CGR tiene como consecuencia una
alteración en el patrón de proyección al NGLd. Este cambio en la especificación de las
CGR es el resultado de la alteración del bucle regulatorio existente entre Zic2 y la
señalización de Shh, como demostramos mediante la electroporación in utero. La
sobrexpresión de Shh en la región VT reduce la expresión de Zic2; por el contrario, la
expresión ectópica de Zic2 dentro de la retina central produce una bajada en los
niveles de expresión de Shh. Por otro lado, la inactivación genética de Sfrp1/2 causa
defectos en la guía de los axones dentro de la retina y desfasciculación de los axones
de las CGR cuando crecen a lo largo de la vía visual. Los defectos de desfasciculación
se podrían deber a un incremento en la actividad de ADAM10, la cual es
negativamente regulada por Sfrps. En efecto, los explantes de retina provenientes de
ratones nulos para Sfrp1/2 presentan un crecimiento desfasciculado de las neuritas;
este defecto fue revertido mediante la adición de un inhibidor específico de
ADAM10.Estas observaciones son asociadas con un incremento en el procesamiento
de las moléculas de adhesión L1 y N-caderina, tanto en la vía visual de los mutantes
de Sfrp1/2 como en explantes que sobreexpresan ADAM10.
En base a estos resultados proponemos que Boc modula negativamente la
señalización de Shh en la región VT de la retina, permitiendo así que se exprese Zic2,
y por lo tanto se genere un número correcto de CGRi. Nuestros datos también indican
que Sfrp1/2 están involucrados en la guía de los axones mediante mecanismos
directos e indirectos.
