Structural studies of AT-rich DNA

Abstract

Non-coding DNA is rich in adenines and thymines. Their unique properties, such as high polymorphism, flexibility, transitional states that lead to DNA hairpin formation and the possibility to adopt either Watson-Crick or Hoogsteen base pairing conformations, in conjunction with its distribution in genomes, suggest the possibility of a structural role. In spite of that, the available structural information for AT-rich oligonucleotides in databases such as Protein Data Bank (PDB) and Nucleic Acids Data Bank (NDB) is very limited in comparison to oligonucleotides of high CG content. These facts have motivated us to undertake the study of the structural characteristics specific for AT-rich oligonucleotides. X-ray crystallography was used for the study of AT-rich oligonucleotides with particular sequences, such as a palindromic sequence suitable for the formation of a DNA hairpin, alternating-AT and A-tracts. Additionally, dynamic light scattering was used to identify the most suitable conditions for initial crystallization trials. The unique properties of AT-rich sequences such a high polymorphism and flexibility constitute ideal features for their possible structural role, but also present difficulties for crystal organization, as required for X-ray crystallography. In several cases, only poor diffracting crystals were obtained. The following structural features were identified in the AT-rich oligonucleotides studied by us: Crystals of the oligonucleotide d((AT)3T3A(AT)3) in a DNA hairpin conformation have been obtained. The structure of the loop appears to be highly variable; as a result, the crystals have low resolution. A tentative model of the hairpin structure has been proposed. The d(A4T4) octamer was crystallized as a complex with the CD27 drug. This drug has previously demonstrated a high antiprotozoal activity, in particular against Plasmodium falciparum and Trypanosoma brucei. The structure obtained shows how the CD27 drug fills completely the minor groove and interacts with molecules of stacked oligonucleotides and with the backbone of neighboring duplexes, stabilizing a complex organization. The elevated number of occurrences of the motif A4 in the genomes of Plasmodium falciparum and particularly in the kDNA of Trypanosoma brucei represents a suitable target for the CD27 drug. The d(CG(AT)4CG)2 dodecamer in presence of Ni2+ crystallizes in the typical pseudo four-way helix-helix junction configuration, with extra-helical and terminal guanines coordinated to nickel. A bis-coordination of Ni2+ with two stacked helical guanines was identified in the structure of d(CG(AT)4CG)2 in the presence of Ni2+ and the CD27 drug. The oligonucleotide d(A6T6)2 in the presence of Mn2+ and the S1010 drug in the crystallization conditions acquires a coiled-coil conformation. The following structures were determined as part of a collaboration in several other projects: The structure of the oligonucleotide d(AATAAATTTATT)2 in presence of different ions exhibits the typical high polymorphism of AT-rich DNA. The ions present in the crystallization conditions modulate the organization of duplexes, most likely through changes in the ionic atmosphere around the DNA duplexes. The structure of the oligonucleotide d(ATTAAT)2 in Hoogsteen conformation demonstrates that any all-AT sequence may adopt the Hoogsteen conformation under appropriate conditions. The structures of d(CGAATTAATTCG)2, d(ATATCGATAT)2 and d(ATATGCATAT)2 in the presence of ligands (ions, peptide or protein), were successfully determined. In the case of d(ATATGCATAT)2 a coiled-coil conformation was found in the presence of Mg2+.

El DNA no codificant es ric en adenines i timines (AT). Les seves propietats úniques com alt polimorfisme, flexibilitat, estats de transició que porten a la formació d'estructures bucle i la possibilitat d'adoptar conformacions de parells de bases Watson-Crick o Hoogsteen, conjuntament amb la seva distribució en genomes, suggereixen la possibilitat d'un rol estructural. Malgrat això, la informació disponible per oligonucleòtids rics en AT en bases de dades (PDB i NDB) és molt limitada en comparació amb la dels oligonucleòtids d'alt contingut en citosina i guanina. Aquests fets ens han motivat per emprendre l'estudi de les característiques estructurals d'oligonucleòtids rics en AT. La cristal.lografia de raigs X s'ha fet servir per l'estudi d'oligonucleòtids rics en AT de seqüències concretes, com ara la seqüència palindròmica per a la formació d'estructures bucle del DNA, l'alternant AT i la d'adenines consecutives. A més, es va utilitzar la tècnica de dispersió dinàmica de llum per identificar les condicions òptimes per a les proves inicials de cristal.lització. Les propietats úniques de les seqüències riques en AT com l'alt polimorfisme i la flexibilitat constitueixen propietats ideals pel possible rol estructural, però d'altra banda comporten dificultats per a l'organització molecular requerida per la cristal·lografia de raigs X. En diversos casos, només es van obtenir cristalls amb difraccions desordenades i de baixa resolució. Dels oligonucleòtids rics en AT estudiats, es van identificar les següents característiques estructurals: Amb l'oligonucleòtid d((AT)3T3A(AT)3) es van obtenir cristalls amb la conformació bucle. L'estructura del bucle es mostra altament variable; com a resultat, els cristalls presenten baixa resolució. Es proposa un model temptatiu del bucle. Es va cristal.litzar el complex de l'octàmer d(A4T4) amb el fàrmac CD27. Aquest fàrmac ha demostrat prèviament una alta activitat antiprotozoària, en particular pel Plasmodium falciparum i pel Trypanosoma brucei. L'estructura resolta mostra com el CD27 omple el solc estret completament i interactua amb molècules d'oligonucleòtics apilats i amb la cadena de fosfats dels dúplexs veïns, estabilitzant una organització complexa. L'elevat nombre d'incidències del motiu A4 en els genomes del Plasmodium falciparum i particularment en el k-DNA del Trypanosoma brucei, representa un lloc d'unió adient per el CD27. El dodecàmer d(CG(AT)4CG)2 en presència de Ni2+ cristal·litza en la típica configuració en pseudo-intersecció hèlix-hèlix de quatre vies amb les guanines extra-helicoïdals i terminals coordinades amb níquel. Es va identificar una doble coordinació de Ni2+ amb dos guanines apilades en l'estructura de d(CG(AT)4CG)2 en presència del fàrmac CD27. L'oligonucleòtid d(A6T6)2 en presència de Mn2+ i del fàrmac S1010 adopta una conformació en superhèlix (coiled-coil). Les següents estructures es van resoldre en col·laboració amb altres projectes: Les estructures de l'oligonucleòtid d(AATAAATTTATT)2 obtingudes en presència de diferents ions mostra el típic polimorfisme del DNA ric en AT. Els ions presents modulen l'organització de dúplexs, probablement degut a canvis en la atmosfera iònica al voltant del DNA. L'estructura de l'oligonucleòtid d(ATTAAT)2 en conformació Hoogsteen indica que qualsevol seqüència completament AT podria adoptar la conformació Hoogsteen en condicions adients. L'estructura dels oligonucleòtids d(CGAATTAATTCG)2, d(ATATCGATAT)2 i d(ATATGCATAT)2 en presència de lligands (ions, pèptid i proteïna), van ser resoltes amb èxit. En el cas de d(ATATGCATAT)2, es va trobar una conformació en superhèlix en presència de Mg2+.