Regeneración de tejido periodontal in vitro con células madre pluripotenciales de la pulpa dental (DPPSC) del tercer molar

Author

Hategan, Iulia Emilia

Director

Al-Atari Abou-Asi, Maher

Codirector

Montori Pina, Sheyla

Date of defense

2016-07-08

Pages

132 p.



Department/Institute

Universitat Internacional de Catalunya. Departament d'Odontologia

Abstract

El periodonto está formado por varios tejidos: la encía, el ligamento periodontal, el cemento radicular y el hueso alveolar. El periodonto tiene dos funciones fundamentales: protección e inserción. La función de protección la realizan la encía y el epitelio de unión, mientras que la función de inserción se desempeña a través del ligamento periodontal, el cemento radicular y el hueso alveolar.- El ligamento periodontal es un tejido celular altamente vascularizado que rodea la raíz del diente. Se compone por haces de fibras de tejido conectivo fibroso que unen el cemento radicular y la pared del alveolo. Presenta una mayor anchura en el extremo cervical, apical y en dientes funcionales, siendo más estrecho en la parte central y en dientes no funcionales. – Las enfermedades periodontales son un conjunto de entidades patológicas de causa infecciosa y naturaleza inflamatoria que afectan a los tejidos que rodean los dientes. Su etiología es multifactorial. La enfermedad periodontal es un importante problema de salud pública y el desarrollo de terapias efectivas para tratar esta enfermedad debería ser un objetivo principal de la comunidad científica. Dependiendo del grado de afectación y de la susceptibilidad del individuo se distinguen dos tipos de enfermedad periodontal: la gingivitis y la periodontitis. La gingivitis se define como la inflamación de los tejidos gingivales sin que exista pérdida ósea y se trata de la enfermedad periodontal más habitual. Sin embargo, si no se trata a tiempo, la gingivitis puede derivar a periodontitis, una enfermedad menos habitual pero con peores consecuencias, ya que afecta al 90% de la población por encima de los 35 años y es la primera causa de perdida de dientes en todo el mundo. La periodontitis se caracteriza por la destrucción del tejido periodontal, incluyendo el ligamento periodontal, el cemento, el hueso alveolar y la encía. La importancia de la periodontitis no está en su prevalencia sino en la morbilidad asociada que conlleva la pérdida de dientes, consecuencia final de la enfermedad periodontal destructiva. En general, se estima que la periodontitis provoca el 30-35% de todas las extracciones dentales. – El objetivo principal del tratamiento periodontal es de prevenir la pérdida de inserción y de regenerar los tejidos del soporte periodontal. En los últimos años se han utilizado diferentes técnicas de tratamiento periodontal, métodos destinados a reproducir o reconstituir una parte perdida o dañada de los tejidos de soporte dentario con el objetivo de restaurar la arquitectura y función de estos tejidos. Las técnicas no-quirúrgicas como la terapia mecánica convencional y los procedimientos quirúrgicos y materiales regenerativos, como por ejemplo la regeneración tisular guiada, el uso de injertos óseos, la aplicación de factores de crecimiento y la modulación de factores del huésped, así como la combinación de varias de estas técnicas. En la mayoría de los casos se consigue una curación a través de un epitelio largo de unión, pero no se consigue una reparación del cemento o el hueso. – Por esta razón se plantea la terapia celular como una posibilidad futura para regenerar el periodonto, la cual requiere la implicación de: células madre, moléculas de señalización y la matriz extracelular tridimensional. – Por definición, una célula madre es una célula indiferenciada que es capaz de autorenovarse y de diferenciarse hacia múltiples tipos celulares. Estas dos propiedades, en conjunto, permiten a las células madre proliferar y regenerar los tejidos perdidos o dañados. Las células madre se han podido aislar de una amplia variedad de tejidos y se pueden clasificar en 3 categorías: células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas y células madre adultas. – Las células madre embrionarias (ESC) son células pluripotentes, que se aíslan de la masa celular interna del blastocito. Las ESC tienen la capacidad de proliferar extensamente manteniéndose en un estadio indiferenciado pero, bajo unas condiciones adecuadas, son capaces de diferenciarse en células con características de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Aunque presentan un gran potencial de proliferación y se pueden mantener indefinidamente en cultivo en un estado indiferenciado, su uso en terapias regenerativas está limitado por cuestiones legales y éticas, ya que para su obtención es necesaria la utilización de embriones. Debido a ésto, se intentaron conseguir poblaciones de células madre pluripotentes a partir de células somáticas mediante modificación genética, llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Estas células tienen la ventaja de ser autólogas, al provenir del propio individuo, lo que evitaría los problemas de rechazo. Sin embargo, las manipulaciones genéticas pueden alterar el crecimiento y desarrollo de las células reprogramadas, lo que dificulta la previsibilidad de su comportamiento y, como tal, limita su aplicación terapéutica en la regeneración de tejidos. Como alternativa se aislaron las células madre adultas de prácticamente todo el cuerpo humano: médula ósea, sangre periférica, músculo esquelético, hígado, páncreas, epitelio de la piel y del intestino, pulpa dental, córnea, retina del ojo, sistema nervioso central y corazón. Sin embargo, la obtención de estas células madre resulta laboriosa, en algunos casos y, en otros, las células obtenidas tienen una capacidad de diferenciación limitada. – Nuestro grupo de investigación del Regenerative Medicine Research Institute de la UIC Barcelona ha conseguido aislar una nueva población de células madre adultas a partir de la pulpa dental de los terceros molares. El tercer molar es el último diente en desarrollarse y contiene una cantidad óptima de tejido pulpar para la extracción de células madre. Estas características de los terceros molares, junto con la utilización de un protocolo de cultivo específico, permitieron el aislamiento de una nueva población de células madre de la pulpa dental, las DPPSC (dental pulp pluripotent-like stem cells). Estas células, a diferencia de otras células madre adultas, tienen una capacidad regenerativa similar a la de las células madre embrionarias, al expresar marcadores de pluripotencia (Oct4, Nanog, Sox2 y Lin28) y tener la capacidad de diferenciarse a tejidos de las tres capas embrionarias, lo cual las convierte en una fuente muy prometedora de células madre para los estudios de medicina regenerativa. – El objetivo de esta tesis doctoral ha sido investigar el potencial regenerativo de las DPPSC para formar tejido periodontal nuevo in vitro usando dientes sanos y estériles como soporte. Nuestro estudio pretende reproducir la topografía de la superficie de la raíz natural del diente para favorecer la elongación celular perpendicular, condición óptima para la regeneración de las fibras periodontales. – Resultados – Se aislaron las células DPPSC del tercer molar y se cultivaron hasta pase 4. Se caracterizaron estas células a través de microscopia óptica y de microscopia electrónica de transmisión (TEM) donde se observaron que las células presentaban un tamaño pequeño, morfología triangular con un núcleo prominente y escaso citoplasma, característica especifica de las células embrionarias. – Para comprobar el fenotipo de las DPPSC indiferenciadas del cultivo primario se analizaron las células mediante citometría de flujo. Los resultados evidenciaron expresiones positivas para los marcadores de membrana: CD105 (92,15%), CD29 (99,63%), CD146 (15,54%), CD45 (0,02%) y para los marcadores de pluripotencialidad: OCT3/4 (70,72%) y NANOG (30,18%). Los resultados de la RT-PCR también revelaron la expresión genética positiva para los marcadores de pluripotencia OCT 3/4, NANOG y SOX-2. – Mediante el análisis de inmunofluorescencia se confirmó el fenotipo de las DPPSC indiferenciadas y los resultados mostraron la expresión del marcador de células adultas CD 13 y el marcador de pluripotencia SSEA4. – Para comprobar la estabilidad genética del cultivo antes de realizar la diferenciación periodontal se realizó la hibridación genética comparativa corta. El perfil genómico analizado en la muestra 8DD fue equilibrado y no se observó ninguna anormalidad cromosómica. – Después de la caracterización de nuestras células DPPSC se realizó la diferenciación de las DPPSC a tejido periodontal. El experimento consistía en sembrar las células DPPSC encima de los dientes sanos y estériles, tratados previamente con FN, y mantenerlas en cultivo durante 21 días en medio osteogénico. En total se sembraron 5 placas, 3 de las cuales (a razón de una por semana) fueron utilizadas para aislamiento de RNA. De las 2 restantes, una se destinó al análisis del SEM y la otra al examen histológico. – Con las muestras obtenidas cada semana, se realizaron las pertinentes RT-PCRs. Se analizó la expresión de diferentes marcadores (ALP, OC, PLAP-1, COL I, COL III, BGN, POSTN, S100A4) entre los 5 grupos (DPPSC, DPPSC diferenciadas en 2D, DPPSC diferenciadas en 3D en la primera semana, segunda semana y tercera semana de diferenciación). Los resultados mostraron altos niveles de expresión para los marcadores óseos y periodontales desde la primera semana a la tercera semana de diferenciación. La expresión de estos marcadores fue mayor que en la diferenciación 2D. – Después de cultivar las DPPSC in vitro durante 21 días, las matrices se analizaron al microscopio electrónico de barrido (SEM). Las imágenes de las raíces a diferentes aumentos (5000X, 15000X y 30000X) mostraron una gran densidad de masa celular encima de las superficies dentales para todas las muestras de DPPSC, indicando la capacidad de las células para adherirse y crecer sobre esa superficie. Después de 3 semanas de diferenciación, el análisis de SEM permitió observar la formación de fibras de colágeno de las matrices dentales. Se observaron algunos vasos sanguíneos y algunos cementoblastos en las muestras del grupo de DPPSC, al igual que en el grupo control positivo, que consistía en el ligamento periodontal de un diente erupcionado. Por el contrario, en el control negativo, que consistía en un diente estéril en el que previamente se había eliminado el ligamento periodontal, no se observó la presencia de células u otro tejido. – Con el fin de visualizar la formación de nuevos tejidos se realizaron las tinciones: tricrómica; Azul alcián y Hematoxilina-eosina (H&E). En los cortes histológicos del grupo de las DPPSC se observó la formación de fibras de colágeno insertadas perpendicular al cemento, pareciéndose a las fibras de Sharpey en comparación al grupo control negativo, donde no se observan estas fibras. A mayor aumento se reveló la homogeneidad de las fibras nuevas de colágeno unidas a las superficies a los 21 días de la diferenciación. – Discusión -- Las células utilizadas en este estudio se aislaron de la pulpa dental de los terceros molares. El desarrollo tardío del tercer molar, permite la extracción de una gran cantidad de células progenitoras. El aislamiento y cultivo de las DPPSC a partir de la pulpa de los terceros molares requiere de unas condiciones de cultivos específicos y bastante estrictos, por lo que es importante caracterizar esta subpoblación antes de realizar los experimentos. – Las DPPSC poseen grandes núcleos alargados, lo que indica su alta capacidad replicativa, característica típica de las células embrionarias. Sin embargo, la expresión del marcador CD13 observado en la inmunofluorescencia nos indica el origen adulto de estas células, por lo tanto, se trata de células adultas con características pluripotentes. La elección de estas células para la realización de esta tesis doctoral se debe a su alta capacidad de diferenciación y su alta proliferación, lo que va ligado a la expresión de marcadores de pluripotencia, como Oct-4, Sox-2, SSEA4 o Nanog, en su etapa indiferenciada. Estas características podrían favorecer la regeneración del ligamento periodontal en las raíces de los dientes. Además, la estabilidad genética observada en estas células es requisito indispensable para su futura aplicación clínica. – En este estudio se ha investigado la capacidad de los dientes humanos para actuar como una matriz óptima in vitro para la regeneración del tejido periodontal humano. Los resultados obtenidos en este estudio han demostrado que los cortes de dientes humanos tratados, junto con células madre de la pulpa dental (DPPSC), parecen constituir una buena combinación para la regeneración completa del tejido periodontal, ya que no solamente se observa la adhesión de estas células a la superficie de la raíz de los dientes, sino que, además, se consiguen generar in vitro gran parte de los componentes de este tejido, como fibras, células y vasos sanguíneos. No obstante el tratamiento de los dientes con la FN mejoró la adhesión de las células a los dientes. – Los estudios demostraron que los tejidos periodontales de ligamentos de diferentes pacientes pueden tener diferentes proteínas o genes. Debido que hasta la fecha, no se ha encontrado un marcador específico para identificar los fibroblastos del ligamento periodontal y diferenciarlos de otras células circundantes en nuestro estudio hemos utilizado más de un marcador periodontal, incluyendo PLAP-1, BGN, POSTN, S100A4, COL I, COL III; y algunos marcadores óseos, incluyendo la fosfatasa alcalina (ALP) y la osteocalcina (OC). – El perfil de expresión del ligamento periodontal mostró que el colágeno tipo I y tipo III fueron los genes más abundantes, lo que les hace ser considerados en nuestro estudio. El colágeno I es la principal proteína de membrana extracelular (ECM) del ligamento periodontal y proporciona un microambiente ideal para que las PDLPs (células madre del ligamento periodontal) se adhieran, proliferen y formen un tejido periodontal. Los ensayos de RT-PCR muestran un aumento de la expresión de este tipo de colágeno durante las dos primeras semanas de la diferenciación y descendiendo en la tercera semana. Este descenso podría estar asociado a un aumento en la mineralización del tejido diferenciado durante la tercera semana, como indica el incremento en la expresión de marcadores óseos como la osteocalcina (OC) o la fosfatasa alcalina (ALP). – La expresión de proteína PLAP-1 en células del ligamento periodontal in vitro está demostrada en algunos artículos y se observó el aumento durante el curso de la citodiferenciación de las células del ligamento periodontal en células formadoras de tejido mineralizado, tales como osteoblastos y cementoblastos. Estas observaciones sugirieron que PLAP-1 está implicada en la formación de la matriz mineralizada en los tejidos periodontales. Los resultados de este estudio muestran un aumento en la expresión de PLAP-1 a lo largo de la diferenciación en 3D, mientras que no se observa expresión de la misma durante la diferenciación en 2D. Este hecho podría estar indicando el papel del diente en la inducción de la diferenciación de las DPPSC hacia tejido periodontal y la mineralización de las mismas, como ya se ha observado que ocurre con otras matrices y otros tipos celulares. – Finalmente, POSTN (Periostin) es una proteína de membrana extracelular (ECM) muy importante para la homeostasis periodontal y mantenimiento del espacio periodontal. Su expresión cambia dinámicamente en respuesta a la tensión y compresión del ligamento periodontal. POSTN juega un papel importante en la respuesta característica de las células periodontales a los estímulos mecánicos y de superficie. En este sentido, los resultados de esta tesis corroboran esa respuesta, ya que, al igual que ocurría con PLAP- 1, POSTN sólo se expresa en la diferenciación en 3D, mientras que no se observa expresión de la misma en la diferenciación en 2D. – En nuestro estudio hemos utilizado un medio de diferenciación osteogénico para la regeneración periodontal, ya que el perfil genético del ligamento periodontal es muy parecido al del hueso. Además, de momento no se ha descrito un medio de diferenciación periodontal específico. Después de 3 semanas de cultivo de las DPPSC en el medio de osteodiferenciación, las imágenes del SEM mostraron un claro incremento en la cantidad de células, similares a los cementoblastos observados en el control positivo de ligamento periodontal. Además, se observó la formación de una matriz extracelular abundante de fibras de colágeno, lo que sugiere que la diferenciación de las DPPSC a ligamento periodontal fue funcional. – Por lo tanto, con los resultados obtenidos en esta tesis doctoral se propone la terapia con DPPSC como un procedimiento alternativo en la medicina regenerativa del ligamento periodontal. Sin embargo, estudios en animales y ensayos clínicos complementarios son necesarios antes de que estas células se puedan aplicar como tratamiento de medicina regenerativa para las enfermedades periodontales.

Keywords

Pulpa dental; Pluripotencia; DPPSC; Marcadores embrionicos; Tejido periodontal; Marcadores periodontales y óseos

Subjects

616.3 - Pathology of the digestive system. Complaints of the alimentary canal

Knowledge Area

Odontologia

Documents

Tesi_ Iulia_Emilia_Hategan.pdf

3.237Mb

 

Rights

L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
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