Systematic functional analyses of spliceosomal components reveal novel mechanisme of alternative splicing regulation

Abstract

Alternative splicing is an essential regulatory layer of gene expression that expands the coding potential of the genome in multicellular organisms. The spliceosome -the sophisticated machinery involved in intron removal- allows versatile regulation of gene expression programs. The splicing process relies on the dynamic interplay between hundreds of components of the spliceosome, and the steps at which the complex process of the splicing reaction can be regulated remain largely unknown. The main objective of this thesis has been to develop high- throughput approaches to systematically identify novel regulators of alternative splicing, as well as to study the mechanisms by which they modulate splice site choice. We have identified a variety of regulators of Fas/CD95 alternative splicing within and outside of the splicing machinery and provide novel insights into connections between iron homeostasis and alternative splicing regulation. Using computational networks, we carried out a systematic functional analysis of the spliceosome components and their regulatory potential. Our results reveal the extensive regulatory plasticity of core spliceosome components throughout its assembly process. They also identified links between alternative splicing and iron homeostasis, providing a mechanism by which iron modulates alternative splicing through regulation of the RNA binding properties of a Zinc knuckle domain in the SR regulatory protein SRSF7. The results of this thesis highlight the value of high throughput technologies and network analyses to study complex molecular mechanisms, and unveils novel functional connections between the splicing machinery and other cellular processes.

El procesamiento alternativo del pre-ARNm constituye uno de los pilares esenciales en la regulación de la expresión génica y expande la capacidad codificadora del genoma en organismos multicelulares. El Espliceosoma – la maquinaria encargada de la eliminación alternativa de los intrones- permite una regulación multifacética de los programas genéticos en el interior de la célula. El proceso de corte y empalme se sustenta en la interacción dinámica de cientos de componentes del Espliceosoma, y los distintos niveles de regulación de la compleja reacción de splicing permanecen aun sin descubrir. El objetivo principal de esta tesis se ha centrado en el desarrollo de tecnologías sistematicas de alto cribado para identificar reguladores potenciales del procesamiento alternativo del pre- ARNm, así como los mecanismos implicados en su regulación. Hemos identificado una gran variedad de reguladores del procesamiento alternativo de Fas/CD95, tanto componentes esenciales del espliceosoma como factores implicados en otros procesos biologicos, y hemos observado una conexión inédita entre la regulación del splicing alternativo y el proceso de homeostasis modulado por hierro. Mediante el uso de redes computacionales, hemos llevado a cabo un análisis sistemático y funcional de los componentes del Espliceosoma y hemos identificado el potencial regulador de los mismos en la reacción de corte y empalme. Nuestros resultados reflejan una inmensa plasticidad de los factores esenciales del Espliceosoma a lo largo de toda a reacción de ensamblaje. Además, hemos conseguido identificar el mecanismo potencial por el cual la homeostasis del hierro ejerce su función en splicing alternativo a través de la modulación de la actividad de unión a RNA -mediada por un dominio de unión a cinc- en la proteína reguladora de splicing SRSF7. Los resultados de esta tesis enfatizan la relevancia de las tecnologías emergentes de alto cribado y el análisis de redes computacionales en el estudio de complejos mecanismos moleculares, y desvelan nuevas conexiones funcionales entre la maquinaria de splicing y otros procesos celulares.