Funcionalització de superfícies amb lligands per a la seva interacció específica amb avidina i estreptavidina

Abstract

Se ha estudiado espectroscópicamente (UV-Vis, Raman, RMN) los equilibrios tautoméricos del ácido 2-(4'-hidroxifenilazo)benzoico (HABA) y el ácido 2-(4'-hidroxi-3',5'- dimetilfenilazo)benzoico. Estos equilibrios están influenciados fuertemente per el estado de protonación (neutro vs. monoaniónico) del compuesto, la polaridad del medio y la substitución en el anillo de hidroxifenilo. En el caso de les especies neutras tanto de HABA como del ácido 2-(4'-hidroxi-3',5'-dimetilfenilazo)benzoico en medios apolares, es predominante el tautómero azo. Aún así, en medios polares, mientras que el tautómero azo es aun predominante para el HABA neutro, el tautómero hidrazona es ampliamente predominante para el 3',5'-dimetil-HABA neutro. En el caso de las especies monoaniónicas, el tautómero hidrazona es predominante tanto para HABA como para el ácido 2-(4'-hidroxi¬3',5'-dimetilfenilazo)benzoico en disolventes apolares. Per otro lado, aumentando la polaridad del medio, el compuesto ácido 2-(4'-hidroxi-3',5'-dimetilfenilazo)benzoico muestra una tendencia mayor que el HABA para continuar siendo tautómero hidrazona.

Se han estudiado les cinéticas de isomerización Z->E térmica de la especie neutra y monoaniónica del ácido 2-(4-metoxifenilazo)benzoico en solución en diferentes medios. Las interacciones entre el disolvente y el cromóforo juegan un papel importante en cuanto a la velocidad de isomerización, siendo mayores (mayor constante cinética) cuanto más apolar es el disolvente tanto para la especie neutra como para la monoaniónica. En cambio, no hay mucha diferencia entre las constantes cinéticas de las isomerizaciones de las especies neutra y monoaniónica, siendo ligeramente mayores para la especie neutra.

Se han sintetizado dos compuestos amfifílicos derivados del HABA y se han estudiado sus monocapas de Langmuir. Al comprimir la monocapa del isómero (E)-ácido 2- (4'-metoxi-3'-N-hexadecilpropanamidafenilazo)benzoico (Me-HABA-C16) se observa la progresiva formación de dominios mientras que no se observan al comprimir la monocapa del isómero (Z)-Me-HABA-C16.

En cambio, al comprimir la monocapa del compuesto ácido 2-(4'-hidroxi-3'-N-hexadecilpropanamidafenilazo)benzoico (HABA-C16) se observa un comportamiento diferenciado, la formación de dominios en forma de aguja, que podríamos atribuir al tautómero hidrazona de este compuesto.

Se han sintetizado dos disulfuros, uno de ellos con el grupo HABA (HABA-S)2 como grupo terminal, y el otro con una cadena de trietilenglicol (EG3-S)2 como grupo terminal. Se han preparado las SAMs de los disulfuros y también SAMs mixtas de los dos disulfuros sobre oro. Todas estas SAMs se han caracterizado mediante voltamperometría cíclica. Se han estudiado mediante voltamperometría cíclica la interacción de la avidina sobre estas SAMs mixtas observando un desplazamiento del pico de reducción del grupo terminal HABA hacia potenciales mas negativos per el efecto de su unión a avidina. Se ha determinado que la relación molar óptima del disulfuro del HABA y disulfuro de trietilenglicol en solución etanólica para la formación de SAMs mixtas con avidina es de 1,0:3,1.

Se ha desarrollado una metodología basada en ligandos de avidina de diferente afinidad, para preparar conjugados heterobifuncionales mediante la unión secuencial de los dos componentes biotinilados a la avidina. Esta metodología utiliza ligandos de avidina de moderada afinidad para bloquear, mediante una unión de tipo divalente, la mitad de los sitios de unión de la avidina y permitir la unión del primer componente biotinilado a los sitios de unión desocupados. A continuación, la transformación del tipo de unión de divalente a monovalente hace disminuir su afinidad por la avidina y permite desplazarlos con el segundo componente biotinilado, generando el conjugado heterobifuncional con avidina como linker entre los dos compuestos funcionales. Los mejores resultados se han obtenido utilizando la resina NovaPEG Wang funcionalizada con el ligando DMPDU, para inmovilizar la avidina a través de una unión de tipo divalente. Una vez incorporado el primer componente biotinilado, la rotura con hidroxilamina del enlace éster que une el ligando DMPDU a la resina, ha liberado el conjugado monofuncional de avidina. A este conjugado monofuncional se le incorpora el segundo componente biotinilado desplazando el ligando DMPDU y generando el conjugado heterobifuncional con avidina como linker entre los dos compuestos funcionales.

The tautomeric equilibrium of 2-(4'-hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) and 2-(4'- hydroxy-3',5'-dimethylphenylazo)benzoic (dimethyl-HABA) acid have been studied by spectroscopy (UV-Vis, Raman, NMR). The tautomeric equilibrium is highly influenced by protonation, polarity of solvent and substitution of the hydroxyphenyl ring.

Two amphiphilic HABA derivatives and have been synthesized and their Langmuir monolayers have been studied.

Gold mixed SAMs of two disulfides, one with an HABA terminal group and the other with a triethylene glycol terminal group, have been prepared. The interaction of these mixed SAMs with avidin has been studied by cyclic voltammetry. This interaction with avidin leads to a shift of the HABA cathodic peak towards more negative potentials.

It has been determined that the optimal HABA disulfide/triethylene glycol disulfide ratio, in order to obtain the more robust avidin SAMs, is 1.0/3.1

It has been developed a methodology to obtain heterobifunctional conjugates of avidin. This methodology uses protein ligands with moderate affinity to block the protein sites of one side of the protein, allowing a further binding of a biotinylated compound to the other side of the protein. Subsequent transformation from divalent to monovalent binding, reduces the affinity with the protein is substituted by a second biotinilated compound giving the heterobifunctional conjugate of avidin. The best results have been obtained with the usage of solid phase resins (NovaPEG Wang functionalizated with DMPDU) to immobilize avidin by a divalent binding.