Influència de la irradiació, la dosi cel·lular i la manipulació ex vivo en l'empelt de cèl·lules hemopoètiques murines transduïdes

Abstract

Per estudiar la influència de la dosi d'irradiació, la dosi cel·lular trasplantada i la manipulació ex vivo en l'empelt de cèl·lules hemopoètiques murines transduïdes amb retrovirus, grups de ratolins receptors C57BL/6J (CD45.2) varen ser irradiats (rang de dosis: 1-9 Gy d'ICT-irradiació corporal total-) i es varen trasplantar amb 0,5 ¥ 106 i 5 ¥ 106 cèl·lules del moll de l'os (MO) murines transduïdes amb vectors retrovírics que contenien el gen marcador EGFP o amb 0,5 ¥ 106 cèl·lules del MO no manipulades. En cada cas també es trasplantaren ratolins no irradiats. Les cèl·lules procedien de ratolins donants B6/SJL (CD45.1) tractats amb 5-FU. Es va analitzar l'empelt a curt (40 dies) i a llarg termini (22 setmanes) i l'expressió del transgen als teixits hemopoètics dels ratolins receptors. No es varen detectar cèl·lules del donant, ni a curt ni a llarg termini en els grups de ratolins no irradiats. No obstant, es va relacionar d'una manera lineal i dosi-depenent la irradiació amb l'empelt hemopoètic, tant a curt com a llarg termini. Independentment de la dosi d'irradiació rebuda i el nivell d'empelt aconseguit, es varen obtenir percentatges similars d'expressió del transgen en tots els grups d'animals trasplantats, suggerint que en aquests animals les respostes immunitàries contra les cèl·lules que expressaven EGFP eren absents o bé suficientment lleus com per no afectar la supervivència de les cèl·lules transduïdes en els receptors. A més, el fet que es mantingués l'elevat percentatge de cèl·lules transduïdes in vivo als 40 dies i a les 22 setmanes després del trasplantament (60,5 ± 15,7 %), indicava que probablement s'havien transduït cèl·lules mare (CMH) amb la mateixa capacitat repobladora que les CMH no transduïdes. El trasplantament de 10 vegades més cèl·lules transduïdes (5 ¥ 106 cèl·lules) o 0,5 ¥ 106 cèl·lules no transduïdes, resultà en uns nivells d'empelt significativament més elevats que quan es trasplantaren 0,5 ¥ 106 cèl·lules transduïdes, a totes les dosis d'ICT analitzades. Aquests resultats indiquen que l'ICT facilita l'empelt de cèl·lules transduïdes o no, de manera dosi depenent; que els ratolins empeltats amb cèl·lules EGFP+ probablement desenvolupen tolerància immunològica a les cèl·lules que expressen el transgen i que, augmentant el número de cèl·lules trasplantades i reduint la manipulació ex vivo necessària per la transducció de les CMH, es facilita l'empelt hemopoètic, un dels principals obstacles que limiten l'ús de teràpies gèniques amb CMH.

To investigate to which extent myeloablation, the graft size and ex vivo manipulation influence the engraftment of retrovirally transduced murine hematopoietic cells, groups of C57BL/6J (CD45.2) mice receiving total body irradiation (TBI) (1 - 9 Gy) or no irradiation were transplanted with either bone marrow (BM) cells transduced with a retroviral vector containing EGFP, at two cell doses, or with fresh BM cells from B6/SJL (CD45.1) congenic mice. Short (40 days) and long-term (five months) engraftment and transgene expression were measured by FACS analysis in the recipient mice. No donor cells were detected in the hematopoietic tissues of non-myeloablated mice, whereas in the irradiated animals, levels of engraftment correlated with the dose of TBI administered. Similar percentages of transgene expressing cells were found in the grafted hematopoietic cells of all groups of mice, regardless of the dose of TBI administered or the level of engraftment achieved, suggesting that the engrafted animals were probably tolerant to EGFP. Transplantation of a 10-fold higher dose of transduced cells or the same amount of fresh non-manipulated cells resulted in significantly higher levels of engraftment in all groups of mice, specially in those irradiated with less than 7 Gy of TBI. Our results indicate that TBI facilitates the engraftment of manipulated hematopoietic cells in a dose-dependent manner, that mice engrafted with EGFP+ hematopoietic cells probably acquire tolerance to EGFP, and that increasing the graft size and reducing the ex vivo manipulation required for retroviral gene transfer of hematopoietic cells also enhance their engrafting potential.