Efecto antioxidante del glutatión aplicado en el medio de descongelación seminal de tres especies de interés pecuario

Author

Gumbao Baño, David

Director

Gadea Mateos, Joaquín

Date of defense

2016-01-18

Pages

154 p.



Department/Institute

Universidad de Murcia. Departamento de Fisiología y Farmacología

Abstract

El uso de muestras seminales criopreservadas es muy habitual en la reproducción asistida humana y de animales con interés en ganadería, así como en la conservación de razas y especies en peligro de extinción. Sin embargo, la congelación y descongelación de muestras seminales implica alteraciones en la membrana y en el ADN del espermatozoide, procesos de apoptosis y modificaciones asociadas al estrés oxidativo (Polge y Jakobsen, 1959; Pursel y Johnson, 1975; Holt, 2000; Thomson et al. 2009). Los espermatozoides y las células del sistema reproductor masculino presentan sistemas de defensa frente a los radicales libres (Sies, 1993). En este contexto, el glutatión es uno de los antioxidantes más ubicuos e importantes en los sistemas biológicos (Gadea et al., 2005). Sin embargo, en ocasiones tiene lugar una producción excesiva de radicales libres, un detrimento en la capacidad total antioxidante o ambas situaciones a la vez. Esta circunstancia implica un desbalance denominado “estrés oxidativo” (Sies y Cadenas, 1985). La adición de antioxidantes a los medios de congelación y descongelación seminal es una alternativa frente al estrés oxidativo (Agarwal et al, 2013). El objetivo principal de esta Tesis fue evaluar el efecto antioxidante del GSH aplicado al medio de descongelación, sobre muestras seminales procedentes de tres especies de mamíferos con importancia en ganadería (porcina, bovina y caprina). En el primer trabajo (Experiencia 1) se evaluó el efecto de la adición de diferentes concentraciones de GSH (1 mM y 5 mM) al medio de descongelación de semen porcino. Las técnicas aplicadas incluyeron el análisis computarizado de imagen (CASA), citometría de flujo y ensayos de fecundación in vitro. En los resultados se observó una reducción en el número de espermatozoides viables capacitados, el número de espermatozoides con cambios en los grupos sulfhidrilo de sus proteínas de membrana, la producción de ERO y la condensación de la cromatina. Se obtuvo un incremento en el número de ovocitos penetrados y en la proporción de cabezas espermáticas descondensadas. Sin embargo, no se evidenció cambio alguno en los parámetros de movilidad evaluados con CASA. En el segundo trabajo (Experiencia 2), desarrollado en bovino, se realizaron ensayos similares a los de la experiencia 1 y se incluyeron nuevos análisis centrados en el estudio del ADN espermático, mediante las técnicas de TUNEL y SCSA. Además, se evaluaron los resultados de las técnicas de fecundación in vitro y desarrollo embrionario.. La adición de GSH supuso un incremento en el número de espermatozoides viables no capacitados, en el porcentaje de penetración y desarrollo embrionario in vitro. Se obtuvo un descenso en la producción de ERO y la fragmentación del ADN. No se observó mejoría en los parámetros de movilidad (CASA) y de reacción acrosómica. El último trabajo (Experiencia 3) tuvo lugar en caprino y fue diseñado con el objetivo de saber si la presencia de la forma reducida (GSH) y/o oxidadada del glutatión (GSSG) en el medio de descongelación tenía algún efecto sobre la funcionalidad espermática. Los ensayos incluyeron la valoración por CASA y citometría de flujo. La adición de GSH supuso un incremento en la movilidad y viabilidad espermática, el número de espermatozoides viables no capacitados y con membrana acrosomal intacta. Se observó una reducción en la producción de ERO y la condensación de la cromatina. A diferencia de lo ocurrido con GSH, la adición de GSSG no reveló efecto alguno sobre los parámetros seminales evaluados Estos trabajos demuestran que la adición de GSH al medio de descongelación seminal mejora los parámetros seminales y la fertilidad de las muestras.


SUMMARY Sperm cryopreservation is widely used in assisted reproduction procedures in humans and in animals, such us domestic livestock and endangered species. Although being the most effective method for the maintenance of seminal samples on a long term, cryopreservation has negative effect on semen quality and fertility (Aitken et al., 2004), because of the temperature drops and osmotic changes (Polge & Jakobsen, 1959). In addition to changes in the plasma membrane and in DNA of spermatozoa. (Pursel & Johnson, 1975; Holt, 2000). The spermatozoa and other masculine reproductive cells have different defense systems against free radicals, including antioxidant enzymatic and non-enzymatic defenses (Sies, 1993). In some conditions, an excess on the production of free radicals, a diminished antioxidant capacity or both situations can lead to an imbalanced condition called “oxidative stress” (Sies & Cadenas, 1985). Supplementation of antioxidants in the freezing and thawing media is an alternative against oxidative stress (Agarwal et al, 2013) In this sense, glutathione is one of the most ubiquitous and important antioxidants in the biological systems. (Gadea et al., 2005). The main aid of this thesis was to evaluate the antioxidant effect of GSH when added to the thawing solution in seminal samples from three species with importance in livestock. In the first study (Experiment 1) it was evaluated the addition of 3 different concentrations of GSH (1 mM and 5 mM) to the thawing solution of board semen, with an incubation time of 0 and 30 minutes. The techniques used were computer assisted sperm analysis CASA, flow cytometry and in vitro assays. The results obtained support the hypothesis, the presence of GSH had a protective effect in some of the seminal parameters studied. It was observed a reduction in the number of capacitated viable spermatozoa, in the number of sperm with changes in sulfhydryl group content in membrane proteins, in the ERO production as well as the chromatin condensation. An increase on the number of penetrated oocytes and decondensed sperm heads was also noted. Nevertheless, there was no evidence of any change in the motility scores recorded by CASA. The second study (Experiment 2), conducted on bovine, incudes apart from the studies developed on experiment 1 new analysis on sperm DNA, by TUNEL and SCSA techniques. Furthermore, it was evaluated the results of the in vitro techniques and the embryo development in presence of GSH in the thawing solution. The collected data from Experiment 2 showed concordance with the results from Experiment 1. With the addition GSH in the thawing solution, it was observed an increase in non-capacitated viable spermatozoa, in the percentage of penetration and in vitro development. ERO production and DNA fragmentation values were reduced. No changes were observed on sperm motility (CASA) o presence of spontaneous acrosome reaction. The third study (Experiment 3) on caprine, was designed with the propose of knowing if the presence of GSH 1 mM and 5 mM or GSSG 2.5 mM in the thawing media has any effect on sperm motility and sperm functionality. This assay included CASA evaluation and flow cytometry. In this case, the samples were incubated 30 and 60 minutes. The collected results demonstrated and increase on motility and sperm viability, in the number of non- capacitated viable spermatozoa and spermatozoa with acrosome membrane untouched. A reduction on the ERO production and on the condensation of chromatin was also observed. Opposite to GSH, the addition of GSSG did not show any effect on the evaluated seminal parameters independent to the exposure time. These studies demonstrate that the addition of GSH to the thawing media improves seminal parameters and fertility on the samples studied.

Keywords

Animales-Reproducción; Inseminación artificial

Subjects

619 - Veterinary science; 636 - Animal husbandry and breeding in general. Livestock rearing. Breeding of domestic animals

Knowledge Area

Ciencias de la salud

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