Caracterización de células madre de la membrana timpánica : estudio de su localización anatómica en modelo animal

Abstract

Objetivos: La membrana timpánica (MT) tiene capacidad de repararse fisiológicamente tras traumatismos, infecciones y otras patologías. Es lógico deducir que existe un nicho de células madre con capacidad regenerativa responsable de la reparación tisular a este nivel, pero existe muy poca información contrastada sobre ello. Nuestro objetivo fue confirmar la existencia y localización de células madre de la MT y realizar su aislamiento y caracterización. Metodología: Se utilizo un modelo murino C57BL/6J de 8-10 semanas, procedente del animalario de la Universidad de Murcia, siguiendo normativa vigente. Para extracción de MT se utilizaron varios protocolos quirúrgicos con inclusión o ausencia de martillo y annulus. Se realizaron técnicas de digestión enzimática y explantes para obtención de cultivo primario. Las células se sembraron a 1,25 x106 en frascos de cultivo de 25cm2 con alfa-MEM suplementado según protocolos estandarizados en estufas a 37ºC y 5% de C02. Se realizaron subcultivos, curvas de crecimiento y cuantificación de la proliferación celular con MTT. Se utilizó citómetro FACSCanto y un panel de 8 Ac monoclonales para la tipificación inmunofenotípica y RT-PCR para expresión de Nestina, Nanog y Slug. Se emplearon medios de cultivo específicos para la capacidad de diferenciación multipotente. El estudio del nicho se realizó mediante cortes histológicos en zonas estructuradas de la MT y análisis histológico convencional e inmuno-histoquímico para Ki-67, Nestina, Tuj-1 y Oct-3/4. Resultados: Se extrajeron 333 tímpanos de 207 ratones, de los que se lograron realizar 25 explantes. La digestión enzimática produjo una baja viabilidad y escasa proliferación celular en relación directa con el tiempo de exposición. En contraste las técnicas de explante produjeron una viabilidad >75% alcanzándose confluencia más rápidamente y durante mayor número de pases que con colagenasa. Los mejores explantes para cultivos primarios incluyeron el martillo y el annulus. En los cultivos primarios se observaron células de morfología epitelial y otras células de morfología fibroblástica. Las curvas de crecimiento demostraron un promedio de 3,54x105 en los explantes con martillo y annulus en comparación con 2,9 x105 y 3,1 x105 en los que no incluyeron annulus. El MTT mostró una proliferación exponencial proporcional al tiempo de cultivo y a la densidad de la muestra inicial. Las células de la MT fueron negativas para CD45, CD19 y citoqueratina, y positivas para CD90, CD105, CD73, (marcadores mesenquimales), así como para Ki67 y Nestina (marcadores de proliferación e inmadurez). Fueron parcialmente positivas para CD34. La PCR mostró positividad para Nanog, Slug y Nestina. La diferenciación adipocítica se demostró por la presencia de tinción celular positiva para Oil Red O; la diferenciación osteocítica por los depositos de calcio Alizarin red, tinción positiva de fosfatasa alcalina e inmunofluorescencia para osteopontina, y diferenciación condrocítica con inmunofluorescencia positiva a colágeno II. Los estudios histológicos fueron positivos para Ki67, Nestina y Oct-3/4 no así como para Tuj-I. Los nichos de células con características de células madres se encontraron en las áreas de engrosamiento de la membrana timpánica junto al mango del martillo y al annulus. Conclusiones: Nuestros datos confirman la presencia en la membrana timpánica de células progenitoras inmaduras con características de células madre. Las células madre de la MT se sitúan preferentemente en la zona de inserción del mango del martillo, y con menor frecuencia en el annulus. La técnica optima de explante para la obtención de cultivos primarios eficaces debe incluir el martillo y el annulus. Las células obtenidas del cultivo de la MT identificadas en nuestro estudio, tienen capacidad de diferenciación multipotencial a líneas celulares mesodérmicas y presentan un fenotipo inmunológico, compatibles con la definición de células madre mesenquimales aceptada por la ISCT, por lo que podrían emplearse en ensayos de terapia celular.

Goals: The tympanic membrane (TM) has the ability to repair after trauma, infections and other diseases. It is logical to conclude that there is a niche of stem cells with regenerative capacity responsible for tissue repair at this level, but there is little authoritative information about it. Our aim was to confirm the existence and location of these cells within the TM and to try to isolate and characterize them. Methododology: An 8-10 weeks mouse model C57BL/6J from the animal facility of the University of Murcia was used following current regulations. For the TM extraction, various surgical protocols were used including combinations of hammer or and annulus extractions. Different techniques were performed to obtain primary cultures including explants and enzymatic digestion. Cells were seeded at a concentration of 1.25 x 106 in 25cm2 culture flasks with alpha-MEM supplemented by standardized protocols in a stove at 37C with 5% C02. Subcultures, growth curves and quantification of cell proliferation was performed with MTT. A FACSCanto cytometer with a panel of 8 monoclonal Antibodies was used for immunophenotypic characterization and RT-PCR for expression of Nestin, Nanog and Slug. Specific culture media for multipotential differentiation capacity were used. To localize the stem cell niche structured sections of different TM areas were performed using conventional histological staining and immunohistochemical analysis for Ki-67, Nestin, Tuj-I and Oct-3/4. Results: 333 eardrums of 207 mice were extracted, of which we were able to perform 25 explants. Enzymatic digestion produced a low viability and low cell proliferation in direct relation to the exposure time. In contrast explants techniques produced viability greater than 75% with confluence being reached more quickly and for most passes compared with collagenase. The best explants for primary cultures included the hammer and the annulus. In primary cultures cell with epithelial and fibroblast morphology were observed. The growth curves showed an average 3,54x105 cells in explants of hammer and annulus compared to 3.1x105 and 2.9x105 cells in the two explants that didn’t include annulus. The MTT showed proportional exponential proliferation to the time of cultivation and initial cell density. TM cells were negative for CD45, CD19 and cytokeratin, and positive for CD90, CD105, CD73, (mesenchymal markers) and Nestin and Ki67 (proliferation markers and immaturity). They were partially positive to CD34. The PCR was positive for Nanog, Slug and Nestin. Adipocyte differentiation was demonstrated by the presence of cell staining positive for Oil Red O. The osteocytic differentiation by calcium deposits Alizarin red, positive staining of alkaline phosphatase and immunofluorescence for osteopontin. Chondrocyte differentiation by collagen II was positive in immunofluorescence. Histological studies were positive for Ki-67, Nestin and Oct-3/4 and not to Tuj-I. Cells with characteristics of stem cells were found in the areas of thickening of the tympanic membrane near the handle of malleus and the annulus. Conclusions: Our data confirms the presence in the TM of immature progenitor cells with stem cell characteristics. TM stem cells are preferably located in the insertion of the handle of the malleus, and less frequently in the annulus. The optimum explants technique for obtaining efficient primary cultures should include hammer and annulus. The cells obtained from culture of TM identified in our study, have multipotential differentiation capacity to mesodermal cell lines and express a immunological phenotype compatible with the definition of mesenchymal stem cells accepted by the ISTC, so could be used in for cell therapy.