Structural and functional studies on Escherichia coli alpha-2-macroglobulin: a snap- trap peptidase inhibitor

Abstract

The balance between proteolytic and antiproteolytic activity is crucial in many biological processes such as nutrition, immune defence, virulence and tissue remodelling. Therefore, it is controlled by several mechanisms, among which by peptidic peptidase inhibitors that are encoded in the genomes of many organisms, representing up to 1% of genes in metazoa but being scarce and sketchy in bacteria. However, among bacterial peptidase inhibitors, some proteins with homology to the highly abundant metazoan a2-macroglobulins (a2Ms) have been described, which may have been acquired by bacteria from metazoa by horizontal gene transfer. Although a 2Ms have been extensively characterised in metazoa, where they play important roles in innate immunity, the biological role, mechanism of action and molecular structure of bacterial a2Ms (ba2Ms) remained largely unknown.

In this thesis, the characterisation of the Escherichia coli a2M, ECAM, was undertaken in order to elucidate its role in the bacterial cell. The results unveiled a novel mechanism of peptidase inhibition, called the snap-trap mechanism, that is probably shared by other monomeric a2Ms, both from bacteria and metazoa. In this, attacking endopeptidases cleave the native inhibitor in an accessible bait region, thus causing a major conformational rearrangement and producing induced species that covalently traps peptidases through a highly reactive thioester bond. The rearrangement, involving most of the 13 domains of ECAM, but also key structural elements of the mechanism, were described by producing the first atomic models of ECAM in both conformations, by using X-ray crystallography and cryo-electron microscopy. Through a covalent trap, ECAM prevents peptidases from cleaving large substrates, such as components of the bacterial cell wall, thus protecting E. coli cells against potentially damaging proteolytic activity. Therefore, it seems that ECAM participates in defence mechanisms in bacteria that thrive in the presence of peptidases, for which this thesis provides the first experimental evidence by in vivo functional assays. In summary, through a multifaceted approach that combined structural, biochemical and functional characterisation, this thesis yielded a mechanistic model for ECAM, significantly enriching our understanding of ba2Ms and providing new insights into bacterial defence mechanisms.

La regulació de l'activitat proteolítica és crucial per al bon funcionament dels organismes, ja que afecta processos biològics com la nutrició, la defensa immunològica, la virulència de determinats microorganismes o la remodelació de teixits. Per això, en el genoma de pràcticament tots els éssers vius s'hi troben gens que codifiquen per inhibidors de peptidases que permeten el control dels enzims proteolítcs mitjançant la reducció de la seva activitat. Els inhibidors de peptidases són molt abundants en el genoma dels animals, on poden arribar a representar fins a un 1% dels gens, però la seva presència en bacteris és limitada. Malgrat això, alguns bacteris necessiten sobreviure en ambients rics en peptidases, com per exemple l'intestí humà, i per tant els inhibidors de peptidases son importants mecanismes de defensa en aquests microorganismes.

Entre els inhibidors de peptidases codificats en els genomes bacterians, se n'han trobat que presenten homologia amb les a2 -macroglobulines (a2Ms) de metazoa, proteïnes altament abundants que participen, entre altres, en la immunitat innata dels animals. Tot i que s'ha postulat que les a2Ms bacterianes provenen de la transferència gènica horitzontal de gens de metazoa, la funció biològica, el mecanisme d'acció i l'estructura molecular d'aquestes proteïnes s'ha mantingut desconeguda.

En aquesta tesi s'ha caracteritzat la a2M bacteriana de Escherichia coli, anomenada ECAM, per tal de definir la seva funció en la cèl•lula bacteriana. Els resultats obtinguts han permès descriure un nou mecanisme d'inhibició de peptidases, el qual s'ha anomenat mecanisme "snap-trap". En aquest, les peptidases que aconsegueixen accedir al periplasma de E. coli tallen la forma nativa d'ECAM en una regió anomenada esquer (bait region). Això causa un canvi conformacional i produeix la forma activada de la proteïna, la qual pot unir covalentment la peptidasa a través d'un enllaç tioèster molt reactiu. Aquest canvi conformacional i els elements estructurals implicats en el mecanisme d'acció d'ECAM s'han pogut descriure mitjançant l'obtenció de models atòmics de la proteïna en les dues conformacions, tant per cristal•lografia de raigs X com per criomicroscòpia electrònica. Un cop atrapades, les peptidases romanen inhibides i no poden tallar substrats d' alts pesos mol•leculars com podrien ser els components proteics de la paret bacteriana, explicant així la funció protectora que ECAM exerceix en la cèl•lula bacteriana i que ha sigut demostrada experimentalment per primer cop en aquesta tesi.

En resum, a través de la combinació d'estudis estructurals, bioquímics i funcionals, s'ha obtingut un model del mecanisme d'acció d'ECAM a la cèl•lula bacteriana. Així, es contribueix a enriquir el coneixement sobre les a2Ms bacterianes i s'aporta informació sobre els mecanismes de defensa que presenten determinats bacteris.