Clinical characterization of the arrhythmogenic cardiomyopathy in the Region of Murcia: genotype-phenotype correlation and identification of signs of early disease= Caracterización de la miocardiopatía arritmogénica en la Región de Murcia: correlación genotipo-fenotipo e identificación de marcadores precoces de enfermedad

Abstract

El objetivo de esta tesis doctoral y de la producción científica derivada de la misma es la caracterización clínica del espectro de la miocardiopatía arritmogénica (bases genéticas, hallazgos inmunohistoquímicos de la unión intercelular, epidemiología y eventos arrítmicos). Esta aproximación es esencial para la mejora en el diagnóstico, la estratificación del riesgo y el manejo clínico de la enfermedad. Los pacientes con el diagnóstico de miocardiopatía arritmogénica fueron reclutados y seguidos clínicamente en la Unidad de Cardiopatías Hereditarias del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca entre los años 2003-2014. Las pruebas complementarias realizadas incluyeron ECG de 12 derivaciones, ECG de señal promediada, prueba de esfuerzo, Holter de 24 horas, ecocardiograma, resonancia magnética cardiaca, estudio electrofisiológico y biopsia endomiocárdica (estas dos últimas pruebas fueron únicamente realizada en una minoría de pacientes). El estudio inmunohistoquímico de las proteínas de la unión intercelular se realizó en las muestra de tejido miocárdico disponibles. A los probandos se les realizó estudio genético mediante secuenciación Sanger (hasta el año 2012) y Next Generation Sequencing a partir de dicha fecha. Los objetivos de esta tesis doctoral se han conseguido tal y como se ha expuesto a lo largo de los diferentes capítulos. • El primer capítulo (Objetivo 1) demuestra la importancia del screening familiar para alcanzar el diagnóstico correcto de miocardiopatía arritmogénica no solo entre los familiares sino también en el probando dado que en muchas ocasiones, no es posible realizar el diagnóstico clínico en una primera valoración. Dada la ausencia de una prueba definitiva para el diagnóstico de la miocardiopatía arritmogénica, solo una evaluación clínica minuciosa que englobe los hallazgos arrítmicos y electrocardiográficos, las alteraciones morfológicas, la genética y la historia familiar permitirá alcanzar un diagnóstico de certeza. • El segundo capítulo estudia las diferencias entre la miocardiopatía arritmogénica predominantemente derecha y la predominantemente izquierda. Dado que estos pacientes presentan a menudo afectación biventricular, esta terminología ilustra de forma adecuada el amplio espectro de enfermedad. Las similitudes y diferencias en el perfil clínico, los eventos arrítmicos, bases genéticas y hallazgos patológicos entre ambos fenotipos se analizan en detalle: • Objetivo 2: - La supervivencia libre de muerte súbita en miocardiopatía arritmogénica es comparada con la de las miocardiopatías más prevalentes (miocardiopatía hipertrófica y miocardiopatía dilatada). - Este análisis muestra una incidencia de muerte súbita mucho más elevada en patientes con miocardiopatía arritmogénica, particularmente a partir de la cuarta década de la vida. - Se observa una alta prevalencia de mujeres entre los pacientes afectados con miocardiopatía predominantemente izquierda (al contrario de la mayoría de varones que se observa entre los pacientes afectados predominantemente con miocardiopatía arritmogénica predominantemente derecha). - Las mujeres presentan arritmias ventriculares a una mayor edad que los hombres. - Solamente un tercio de las arritmias ventriculares sostenidas y casos de muerte súbita se relacionaron con el ejercicio. - Un ratio volumen de ventrículo derecho/volumen de ventrículo izquierdo <1, dilación leve de ventrículo izquierdo, la presencia de realce tardío en la resonancia magnética y la no compactación de ventrículo izquierdo son características típicas de la miocardiopatía arritmogénica predominantemente izquierda. - La no compactación de ventrículo izquierdo se detecta hasta en el 30% de los pacientes afectados con miocardiopatía arritmogénica predominantemente izquierda. - Ni la presencia de no compactación ni la presencia de realce tardío se asoció con un mayor riesgo de muerte súbita, taquicardia ventricular sostenida o síncope. Sin embargo la prevalencia de no compactación fue mayor en los casos con disfunción ventricular más severa. - -Una fracción de eyección inferior al 45% en miocardiopatía predominantemente izquierda identifica a pacientes con un mayor riesgo de sufrir arritmias ventriculares. - Algunas de las familias estudiadas presentan una elevada prevalencia de cáncer. Esta combinación llevó al diagnóstico inicial erróneo de miocardiopatía dilatada secundaria a antraciclinas. La hipótesis de la exposición a antraciclinas como modulador de este fenotipo requiere ser investigada. - El estudio genético demostró importantes diferencias entre ambos fenotipos: Mutationes que causan el truncamiento en desmoplakina y la mutación fundadora Europea PLN p.R14del fueron frecuentemente identificadas entre los pacientes afectados con miocardiopatía predominantemente izquierda. Estas mutaciones muestran una elevada penetrancia. Por otro lado, los pacientes afectados con miocardiopatía arritmogénica predominantemente derecha presentaron una mayor variedad mutacional. Muchos de ellos eran portadores de mutationes missense o variantes de significado incierto. - La diferencia en las bases moleculares entre los dos fenotipos se aprecian también a nivel tisular. Estos hallazgos se descubrieron en el estudio inmunohistoquímico de algunos importantes componentes de la unión intercelular. - Un patrón inmunohistoquímico normal de Cx43 (uno de los componentes de las gap junctions y uno de los elementos clave para el intercelular coupling) y de en plakoglobina (una proteína desmosómica, responsable del anclaje mecánico y regulados de importantes vías de señalización) se observó en las muestras de miocardiopatía predominantemente izquierda. Este hallazgo contrasta con el remodelado frecuentemente observado en muestras provenientes de miocardiopatía predominantemente derecha. -La reducción en la expresión de plakoglobina y Cx43 en la unión intercelular depende del fenotipo predominante de enfermedad. -La redistribución de la plakoglobina (también conocida como ϒ-catenina) hacia el núcleo celular puede interferir con la actividad transcripcional regulada por el complejo β-catenina/T-cell factor/lymphoid enhancer factor. Sin embargo, el papel concreto de la interación β-catenina/ ϒ-catenina en la fisiopatología de la miocardiopatía arritmogénica debe ser aclarado. -El acoplamiento eléctrico entre células vecinas depende de la integridad de las gap junctions. Además de la reducción en la expresión de la Cx43 y de Nav1.5 (principal componente del canal de sodio), los modelos de miocardiopatía arritmogénica muestran una reducción de las corrientes iónicas INa y IK1 , lo que puede afectar a la propagación del impulso eléctrico. La significación de estas alteraciones en la arritmogénisis de la enferemdad deberá ser investigada. • Objetivo 3 -La afectación de ventrículo izquierdo en miocardiopatía arritmogénica ha sido considerado tradicionalmente un signo de enfermedad avanzada y signo de mal prognóstico, debido a la progresión a insuficiencia y arritmias ventriculares. Este estudio demuestra una incidencia de muerte súbita y arritmias ventriculares similar entre ambos fenotipos. - Especial interés se prestó a aquellos pacientes portadores de DAI. En este grupo, la incidencia anual de terapias apropiadas fue similar. Solamente aquellos pacientes portadores de DAI en prevención secundaria o en aquellos en los que la indicación fue una arritmias ventricular sostenida bien tolerada o síncope sufrieron terapias durante el seguimiento. -Este hallazgo es importante para optimizar la indicación de implante de DAI dada la elevada prevalencia de complicaciones (1 de cada 5 pacientes) relacionadas con el implante o detectadas durante el seguimiento. -Es importante subrayar la asociación entre valores reducidos de DTI tricuspídeo (<10 cm/s) y la presencia de arritmias ventriculares durante el seguimiento en pacientes portadores de DAI (tanto en casos de miocardiopatía predominantemente derecha como predominantemente izquierda). Esta asociación puede ser explicada por el hecho de que los fenotipos más severos (aquellos casos con mayor dilatación ventricular, mayor disfunción sistólica y afectación biventricular importante típicamente presentan DTI tricuspídeo reducido. -Del mismo modo, los casos más severos presentaron más taquicardias ventriculares no sostenidas en los electrogramas. Sin embargo, este hallazgo no se asoció con una mayor incidencia de terapias apropiadas durante el seguimiento. • Objetivo 4: -La identificación de signos precoces de enfermedad en familiares sanos es muy importante para la planificación del seguimiento cardiolólógico y la identificación de individuos potencialmente en riesgo. - Se diseñó un nuevo software para el análisis del ECG digital en estos pacientes y en sus familiares. El objetivo fue identificar signos de enfermedad precoz mediante el análisis detallado de la morfología del QRS, ST y onda T. -Se identificó la fragmentación del final del QRS asociada a una morfología plana o descendente del segmento ST en derivaciones inferolaterales como un hallazgo frecuente en portadores genéticos sanos. Por el contrario, la pendiente del segmento ST presenta una pendiente ascendente en el grupo control. -Esta sencilla herramienta diagnóstica permite optimizar el estudio familiar en miocardiopatía arritmogénica, señalando posibles potadores genéticos. - La hipótesis de la fragmentación final del QRS asociada a una morfología plana o ligeramente descendente del segmento ST como un signo que precede la inversión de la onda T deberá estudiarse en futuros estudios. • El tercer capítulo estudia las bases genéticas de la miocardiopatía arritmogénica y su correlación fenotípica. La investigación se centra en tres objetivos: el estudio genotipo-fenotipo en portadores de mutaciones que originan truncamientos en desmoplakina, la identificación de nuevos genes involucrados en miocardiopatía arritmogénica y la correlación genotipo-fenotipo de la mutación fundadora PLN p.R14del. • Objetivo 5: -Se centra en la caracterización clínica de la miocardiopatía predominantemente izquierda causada por la una mutación no descrita previamente en DSP (p.Q447*) y en todas la mutaciones de truncamiento en desmoplakina descritas hasta la fecha. - La desmoplakina se encuentra formada por tres dominios funcionales: cabeza, cuerpo y cola. El dominio carboxi-terminal (cola) es reponsable de la unión a los filamentos intermedios de desmina, mientras que el amino-terminal (cabeza) es responsable de la unión a la plakoglobina y plakofilina-2. El cuerpo es responsable de la formación de los dímeros de desmoplakina. -Esta mutación origina una sustitución C por T en el exón 11 del gen DSP lo que origina un codón de stop. Esta alteración se produce en el extremo amino-terminal, produciendo un truncamiento del 85% de la longitud de la proteína. El aminoácido afectado se encuentra en la posición 447, en la cabeza de la proteína. Como se ha señalado anteriormente, el análisis inmunohistoquímico realizado en biopsia endomiocárdica demostró un patrón normal de plakoglobina, desmoplakina, Cx43 y desmina. La presencia de patrón normal de desmoplakin sugiere un efecto dominante-negativo de esta mutación. -Los truncamientos de desmoplakina, independientemente de su posición en la proteína se comportan agresivamente causando una miocardiopatía generalmente precoz, que asocia elevada prevalencia de arritmias ventriculares y muerte súbita. -El diagnóstico de miocardiopatía predominantemente izquierda causada por un truncamiento en desmoplakina debería ser sospechada en presencia de miocardiopatía dilatada y/o miocardiopatía no compactada asociada a arritmias ventriculares e historia familiar de arritmias ventriculares o muerte súbita. Esta miocardiopatía presenta frecuentemente inversión de la onda T en derivaciones inferolaterales y realce tardío en la resonancia magnética cardiaca. -El reconocimiento de miocardiopatía arritmogénica predominantemente izquierda causada por DSP p.447* u otras mutaciones de truncamiento en desmoplakina es importante debido a la elevada incidencia de arritmias ventriculares que presentan estos pacientes. Por este motivo, el implante de un DAI en prevención primaria debe ser considerado antes de alcanzar la disfunción sistólica severa. • Objetivo 6 - La utilización de Next Generation Sequencing permite la identificación de nuevos genes involucrados en el desarrollo de miocardiopatías. Por vez primera se describe una mutación (LDB3 p.T351A) in Cypher/ZASP, una proteína sarcomérica de la línea Z, en una familia afectada por miocardiopatía arritmogénica predominantemente derecha. -Esta mutación de tipo missense se localiza en el exon 7 y ha sido previamente asociada al desarrollo de miocardiopatía dilatada y miocardiopatía no compactada. -Cypher/ZASP se une a α-actinina en la línea Z del músculo esquelético y cardiaco y desempeña un importante papel en el mantenimiento de la estructura celular. Además de ser causa de miocardiopatía, mutaciones en este gen pueden producir afectación neuromuscular. -El mecanismo patogénico por el que esta mutación en LDB3 causa miocardiopatía arritmogénica requiere ser investigado. Este hallazgo subraya la complejidad de la base genética de la miocardiopatía arritmogénica al ser este un nuevo gen no desmosómico involucrado en esta enfermedad. -LDB3 debería ser incluido en el panel de genes a estudio en casos de miocardiopatía arritmogénica. • Objetivo 7 - Se identifica por primera vez una familia española afectada por miocardiopatía arritmogénica causada por la mutación Europea fundadora PLN p.R14del. -Fosfolamban es una proteina formada por 52 aminoácidos que regula la función de la bomba transportadora de calcio (SERCA2a) en el retículo sarcoplásmico del musculo cardiaco. Esta proteína inhibe SERCA2a en su forma no fosforilada. Esta inhibición cesa con su fosforilación. Fosfolamban es esencial en la regulación de la homeostasis del calcio y en la regulación del gasto cardiaco ante la respuesta del estímulo β-adrenergico. - PLN p.R14del causa una delección que no afecta al marco de lectura. Esta mutación causa miocardiopatía arritmogénica, miocardiopatía dilatada con frecuente afectación biventricular. -El estudio de microsatélites sugiere la existencia de un ancestro común Europeo. Esta familia es un ejemplo claro de la variabilidad fenotípica observada entre familiares y enfatiza el concepto de miocardiopatía arritmogénica como un amplio espectro de enfermedad. -La presencia de QRS de bajo voltaje en pacientes afectados con miocardiopatía arritmogénica es un “signo de alerta” que sugiere una posible mutación en PLN. • El cuarto capítulo (Objetivo 8) describe las bases genéticas de la inflamación en la miocardiopatía arritmogénica, así como sus implicaciones clínicas. Desde un punto de vista clínico, es importante reconocer los siguientes puntos de interés: -La miocarditis puede ser la primera manifestación clínica de la miocardiopatía arritmogénica. Este hecho debe ser tenido en cuenta especialmente cuando se la miocarditis se produce en familiares afectados por miocardiopatía arritmogénica. - Estos miocarditis-like episodios manifiestan una progresión de la enfermedad y pueden acompañarse de empeoramiento de la función sistólica, aumento del patrón de realce tardío en la resonancia magnética o arritmias ventriculares. -La concentración de episodios de miocarditis entre familiares portadores de la misma mutación sugiere una vulnerabilidad miocárdica determinada genéticamente. La etiología de estos episodios (origen vírico versus degeneración miocárdica primaria deberá ser investigada). - El estudio microbiológico de tejido miocárdico no demostró la presencia de ADN viral. -El estudio inmunohistoquímico demostró la presencia de linfocitos CD4+ y macrófagos CD68+ en el infiltrado inflamatorio. No se identificaron linfocitos CD8+. Este patrón inflamatorio es similar al encontrado en las reacciones de hipersensibilidad tipo IV. -El reconocimiento de que la miocarditis puede ser la manifestación inicial de una miocardiopatía arritmogénica es importante no sólo desde el punto de vista clínico, sino también desde el punto de vista anatomopatológico: o La presencia de una miocarditis linfocítica de afectación predominantemente derecha debería hacer sospechar el diagnóstico de miocardiopatía arritmogénica en un estadío precoz, antes que se produzca la sustitución fibroadiposa. En este contexto, el remodelado de plakoglobina y Cx43 de las uniones intercelulares sugiere el diagnóstico de miocardiopatía arritmogénica derecha. o El remodelado de plakoglobina ha sido descrito en casos de miocarditis altamente arritmogénica como la miocarditis de células gigantes y la sarcoidosis cardiaca. Sin embargo, esta alteración no ha sido descrita en miocarditis linfocítica.

SUMMARY The goal of this thesis and all the scientific production derived from this research is to characterize the whole spectrum of arrhythmogenic cardiomyopathy (genetic background, immunohistochemistry of the main proteins of the intercalated disks, epidemiology and arrhythmic outcomes). This multidisciplinary approach is essential to improve the diagnosis, risk stratification and clinical management of this disease. Patients diagnosed with ACM were consecutively enrolled in the Inherited Cardiac Disease Unit of the Virgen de la Arrixaca University Hospital between the years 2003-2014. The investigations carried out included 12 leads ECG, signal averaged-ECG, exercise test, 24-hour Holter monitor, 2D-echocardiogram, cardiac magnetic resonance, electrophysiological study and endomyocardial biopsy (the last two tests were performed in a minority of cases). Immunohistochemistry of the intercellular junctions were carried out in the myocardial samples available in addition to the conventional histology techniques. Probands underwent genetic testing (Sanger sequencing before 2012 and Next Generation Sequencing from 2012 onwards). The proposed aims for this research have been accomplished as it is explained throughout this thesis. • The first chapter (Aim 1) demonstrates the importance of the family screening for the correct diagnosis of arrhythmogenic cardiomyopathy not only amongst the relatives but also in probands, in whom the definitive diagnosis is usually not made in the initial evaluation. In the absence of a gold standard test for the diagnosis of this disease, only a detailed clinical evaluation comprising electrocardiographic, arrhythmic and morphological abnormalities, genetics and a detailed family history will allow to reach the final diagnosis. • The second chapter (Aims 2-4) is focused on the differences between right and left dominant phenotypes. Since biventricular involvement is often found in both groups (either in imaging or pathologic studies) the terms right dominant (RDACM) and left dominant arrhythmogenic cardiomyopathy (LDACM) were adopted to illustrate the spectrum of the disease. Similarities and differences in the clinical profile, arrhythmic events, genetic background and pathological findings between phenotypes are analyzed in detail: • Aim 2: -The survival free from sudden death in arrhythmogenic cardiomyopathy patients is compared with that found in the most prevalent cardiomyopathies (hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy). This analysis shows a remarkably higher incidence of sudden death in the arrhythmogenic cardiomyopathy group, particularly after the fourth decade of life. -There is a high prevalence of females amongst LDACM patients (contrary to the higher prevalence of males in RDACM). Females are usually diagnosed later in life. -Females usually suffer malignant arrhythmias later in life than their male counterparts. -The association of malignant arrhythmias and sudden death with exercise was low. In only one third of the cases that suffered the composite sudden death/ventricular fibrillation/sustained ventricular tachycardia was the event exercise related. - A RV/LV volume ratio <1 in cardiac magnetic resonance, a mildly dilated LV and a high prevalence of LGE and LVNC were distinctive features in LDACM compared to RDACM. -Superimposed LVNC was present in up to 30% of the LDACM patients. Neither LGE nor LVNC were associated with a higher risk of sudden death, sustained ventricular tachycardia or syncope. However, the presence of LVNC was associated with a more severe systolic disfunction. -A LVEF< 45% was found to be a sensitive cut-off value for the identification of subjects at risk of ventricular arrhythmias in LDACM. -Some families presented a high prevalence of cancer, which initially led to the diagnosis of anthracycline cardiomyopathy. The question whether anthracycline exposure may accelerate the development of the cardiomyopathy or modulate its expression resulting in a more severe phenotype will require further research. -The genetic testing demonstrated differences in the genetics between phenotypes: Desmoplakin truncating mutations and the European founder mutation PLN p.R14del were frequently identified in LDACM patients. These mutations segregated with a high prevalence in these families. On the other hand, a wider range of mutations were found in RDACM, many of them, bearing missense mutations and variants on unknown significance. -The difference in the molecular basis of the disease is not only present in their genetic basis but also did they exist at a tissue level. These finding was observed in the immunohistochemical analysis of some important proteins present in the intercalated disks: Normal Cx43 (one of the component of the gap junctions and a key responsible for the intercellular coupling) and plakoglobin patterns (a component of the desmosomes, responsible for the mechanical intercellular coupling and regulator of important intracellular signalling pathways) was consistently normal in LDACM, contrary to the abnormal expression found in RDACM samples. Therefore, the reduced junctional signal for plakoglobin and Cx43 appears to track with the predominant phenotype of the disease. -The redistribution of the plakoglobing (also known as ϒ-catenin) to the nucleous may interfere with the transcriptional activity regulated by the β-catenin/T-cell factor/lymphoid enhancer factor complex. However, the precise role of the interaction β-catenin/ ϒ-catenin in the pathogenesis of arrhythmogenic cardiomyopathy remains to be clarified. The electrical intercellular coupling between neighbour cells depends on the integrity of the gap junctions. Aside from a reduced Cx43 and Nav1.5 (the major protein of the Na channel), experimental models show abnormal ion currents (reduced INa and IK1) which could affect the electrical propagation of the electrical impulse. The role of these abnormalities in the arrhythmogenesis remains to be clarified. • Aim 3: -LV involvement in arrhythmogenic cardiomyopathy has been traditionally considered a sign of advanced disease and bad prognosis leading to heart failure and ventricular arrhythmias. However, the incidence of ventricular arrhythmias was similar in both phenotypes. -Special attention was paid to the carriers of an ICD in whom the annual rate of appropriate therapies was similar. Only patients fitted with an ICD for secondary prevention, hemodinamically stable sustained ventricular tachycardia or syncope suffered appropriate therapies during the follow-up. -The recognition of this fact in important in order to optimize the indications for an ICD, since this group of patient present a high rate of complications (almost 1 in 5 patients), either derived from the implantation or during the follow-up. -It is important to highlight the strong association between reduced tricuspid DTI values (<10 cm/s) in carriers of an ICD and sustained ventricular arrhythmias during the follow-up in both RDACM and LDACM patients. -This association may be explained by the fact that that the most severe phenotypes (severe ventricular dilatation, severe systolic dysfunction and extensive biventricular involvement) shows reduced DTI values. -The presence of non sustained ventricular tachycardia in the ICD electrograms was more frequently found in patients with the most severe phenotypes. However, they did not predict appropriate therapies during the follow-up. • Aim 4: -The identification of early signs of disease is healthy relatives of patients affected with arrhythmogenic cardiomyopathy is paramount to optimize the cardiac evaluation and the identification of individuals potentially at risk. -A novel informatic software was designed and implemented in order to analyze early electrocardiographic abnormalities in genotype positive-phenotype negative individuals. QRS, ST and T wave morphologies were analysed in detail. -This analysis allowed the identification of final inferolateral QRS fragmentation associated with a flat or negative ST slope as a frequent electrocardiographic finding found in healthy carriers. On the contrary, the ST slope presented a positive slope in healthy wild-type individuals. This is a useful tool in the family screening since it may indentify genetic carriers. -The question whether this finding will progress towards a future T wave inversion should be evaluated in future studies. • The third chapter focuses on the genetic background of the arrhythmogenic cardiomyopathy patients and its phenotypic correlation. It is focused on three issues: the genotype-phenotype correlation in desmoplakin truncating mutations, the identification of new genes involved in arrhythmogenic cardiomyopathy and the genotype-phenotype correlation of the European founder mutation PLN p.R14del. • Aim 5: -The first part describes the clinical characterization of LDACM caused by the novel DSP p.Q447* mutation and all the previously reported desmoplakin truncating mutations. -Desmoplakin comprises of three major functional domains: head, body and tail. The carboxy-terminal domain is responsible for binding to desmin intermediate filaments whilst the N-terminal domain links desmoplakin to plakoglobin and plakophilin-2. The body is responsible for the formation of protein dimmers. -The mutation was a C to T transition at exon 11 in the DSP gene leading to a premature stop codon. This change occurred at the N-terminal region, and it is thought to generate a truncated peptide (85% in length). The affected amino-acid at position p.Q447* is located in one of the globular head domains of desmoplakin. -As previously stated (Aim 2), myocardial samples from endomyocardial biopsy failed to demonstrate plakoglobin, desmoplakin, Cx43 or desmin remodelling. The presence of a normal desmoplakin pattern in the intercalated disk suggests a negative-dominant effect. -Truncating mutations in desmoplakin, regardless of their position on the protein, behave aggressively and are characterized by early clinical presentation, a high burden of arrhythmias and sudden death. -LDACM caused by DSP truncating mutations should be suspected in the presence of dilated cardiomyopathy and/or left ventricular non compaction associated with ventricular arrhythmias or family background of ventricular arrhythmias or sudden death. This phenotype frequently associates inferolateral T wave inversion and late gadolinium enhancement in cardiac magnetic resonance. -In view of the highly arrhythmic burden present amongst patients harbouring DSP p.Q447* or other desmoplakin truncating mutations, the indication of an ICD should be considered before reaching a severe systolic dysfunction. • Aim 6: -The implementation of Next Generation Sequencing allows the identification of new genes involved in cardiomyopathies. For the first time, we described a mutation in the Z-line protein (LDB3 p.T351A) in a family affected with classic RDACM. This missense mutation is localized in exon 7 has been previously reported to cause dilated cardiomyopathy and left ventricular non compaction. -Cypher/ZASP is a cytoskeletal protein which binds to α-actinin in the Z-line of skeletal and cardiac myocites. Aside from cardiomyopathies, mutations in this protein have been linked to neuromuscular diseases. This protein plays a key role in maintaining the cardiac structure through the interaction with other Z-line proteins. -The molecular mechanism that explains the link between LDB3 and arrhythmogenic cardiomyopathy will require further research. The present finding highlight the complexity of the genetic basis of the disease since a mutation in another non-desmosomal gene emerges as a cause of the disease. -LDB3 should be included in the screening panel for genetic testing alongside other non-desmosomal genes. • Aim 7: -A family affected with arrhythmogenic cardiomyopathy caused by the European founder mutation PLN p.R14del is studied. -Phospholamban is a 52 amino acid protein that regulates the sarcoplasmic reticulum Ca2+ (SERCA2a) pump in cardiac muscle. This protein is an inhibitor of SERCA2a in its unphosphorylated state. The inhibition is relieved upon phosphorylation. Phospholamban is essential for maintaining Ca2+ homeostasis and the cardiac output in response in response to β-adrenergic stimuli. -PLN p.R14del causes the deletion of three nucleotides that does not affect the reading frame. It is a European founder mutation that causes RDACM and dilated cardiomyopathy usually with biventricular involvement. -The microsatellite analysis suggests the existence of a common European ancestor. -This family is a clear example of the variability of the clinical phenotype of the disease in relatives. This fact highlights the concept of arrhythmogenic cardiomyopathy as a broad spectrum of disease. -The presence of Low QRS voltages in patients affected with arrhythmogenic cardiomyopathy is a red flag that may suggest an underlying mutation in PLN. • The fourth chapter (Aim 8) is focused on the genetic basis of inflammation and the clinical implications of myocarditis in arrhythmogenic cardiomyopathy. From a clinical perspective it is important to recognize the following facts: -Myocarditis may be the first clinical presentation of arrhythmogenic cardiomyopathy. This fact should be draw attention to the possible diagnosis of arrhythmogenic cardiomyopathy in relatives. -These myocarditis-like episodes reflect a progression of the disease and it may associate impairment of the systolic function, gadolinium pattern on cardiac magnetic resonance or ventricular arrhythmias. -The myocarditis cluster found in relatives harbouring the same mutations suggests a genetically determined vulnerability to these episodes. The aetiology of these episodes (viral versus primary myocardial degeneration remains to be elucidated). -We failed to demonstrate the presence of viral DNA in myocardial samples. - Immunohistochemistry demonstrated the presence of lymphocytes CD8+ and macrophages CD68+, a pattern similar to that found in type 4-hypersensitivity response. - The recognition of the fact that myocarditis may be the first clinical manifestation of arrhythmogenic cardiomyopathy is not only important in clinical practise, but also in the pathological arena: o Lymphocytic myocarditis circumscribed to the RV should rise the suspicion of a very early stage RDACM. In this scenario, the remodelling of plakoglobin and Cx43 from the intercellular junctions suggests underlying RDACM. o Plakoglobin remodelling has been reported in highly arrhythmic granulomatous myocarditis such as giant cells myocarditis or cardiac sarcoidosis. However, this abnormality was not observed in cases of lymphocytic myocarditis.