Estudio de Pga26, una proteína implicada en la arquitectura de la pared celular de Candida albicans

Abstract

El gen PGA26 del hongo dimórfico Candida albicans, también conocido como orf19.2475, CA2885 e IPF 7204, codifica una proteína GPI de pared celular putativa, cuya función hasta la fecha no ha sido establecida. Estudios previos, realizados por nuestro grupo de investigación, sobre la regeneración de la pared elular por protoplastos de C. albicans pusieron de manifiesto que el gen PGA26 está sobre-expresado a los 60 min de la regeneración de la pared celular en protoplastos. Este hallazgo podría indicar un papel importante de Pga26 en la arquitectura y/o biosíntesis de la pared celular, por ello se realizaron estudios más detallados sobre la posible funcionalidad de esta proteína. El gen PGA26 presenta dos alelos idénticos en el genoma de C. albicans y no es esencial pues la interrupción del mismo no causa letalidad; además su ausencia no afecta de manera significativa a la velocidad de crecimiento. Mediante un análisis in sílico, Pga26 posee todas las características propias de una proteína de pared celular: presencia de péptido señal en la región N-terminal, un sitio teórico de anclaje glicofosfatidilinositol (GPI) en la región C-terminal, un elevado porcentaje de serina y treonina, y presencia sitios teóricos de N-glicosilación (N-X- S/T). La carencia de proteína Pga26 funcional se manifestó en una serie de efectos, tales como una mayor sensibilidad a agentes que interfieren en la biogénesis de la pared celular, como el calcoflúor white, rojo Congo, SDS y también a la digestión con zimoliasa (complejo enzimático con actividad β-1,3-glucanasa). Estos resultados sugieren un papel importante de Pga26 en la arquitectura y/o composición de la pared celular. La respuesta de la célula a la ausencia de Pga26 se manifestó en la presencia de tres veces más de β-1,6-glucano en la pared celular del mutante homocigótico, habiendo por tanto una alteración en la relación entre los distintos polímeros que constituyen la pared celular (glucano, quitina, manoproteínas) y por ende una alteración en la composición de la pared celular. El mutante homocigótico presenta diferencias muy notables en la sensibilidad y resistencia a algunas drogas, siendo más resistente a tunicamicina y caspofungina y más sensible a ketoconazol, anfotericina B, fluconazol y posaconazol que la cepa parental. Tanto el mutante heterocigótico como el homocigótico en el gen PGA26 muestran una mayor resistencia al estrés ambiental (térmico 55 ºC y osmótico al CaCl2), siendo ligeramente más sensibles al estrés oxidativo (H2O2) en comparación con la cepa parental. Llama la atención el hecho de que la ausencia de Pga26 se manifieste, también, en una mayor velocidad en la emisión de tubos germinativos así como su capacidad para emitirlos incluso en condiciones en las que la cepa parental es incapaz de miceliar, por lo que Pga26 podría actuar como represor del proceso. El porcentaje de formación de biopelículas está aumentado en los mutantes heterocigótico (PGA26/pga26) y homocigótico (pga26/pga26), en comparación con la cepa parental. Es importante señalar la influencia de Pga26 en la virulencia de C. albicans en modelos murinos; el mutante nulo pga26/pga26 presenta una menor virulencia que la cepa parental, quedando el mutante heterocigótico en una situación intermedia, lo que indicaría un efecto dosis dependiente. Según el análisis del perfil transcripcional, la ausencia de Pga26 no altera significativamente la expresión de otros genes, bajo las condiciones estudiadas.

Pga26 is a putative GPI-anchored protein, also known as orf19.2475, CA2885 and IPF 7204, of unknown function. Previous studies performed by our group found that PGA26 is induced in protoplast during cell wall regeneration, for this reason we decided select it for a deeper study. The deduced amino acid sequence showed that Pga26 contains an N-terminal hydrophobic signal; it is rich in serine (10.7%) and threonine (17.6%) amino acids, has a putative N-glycosylation signal and a potential GPI (glycosylphosphatidylinositol) attachment signal. To investigate the possible role of PGA26, construction of null mutant by targeted gene disruption and analysis of the resulting phenotype was carried out. Homozygous mutant pga26/pga26 had an increased sensitivity to calcofluor white, Congo red, SDS and zymolyase, when compared with the parental strain, indicating changes in the cell wall. The analysis of the cell wall polymers composition showed that the null mutant has a bigger amount of β- 1,6 glucan than the parental strain. These results suggest that the lack of PGA26 leads to a defective cell wall. It is interesting to point out that the kinetic of the germ tube formation and the biofilm formation was increased in pga26/pga26 strain. We analyzed the behaviour of the mutants to different stress conditions. The pga26 null mutant strain was more resistant to osmotic stress (CaCl2) and heat shock (55ºC) than the parental one. The effect of different drugs, such as Tunicamycin, Amphotericin B and Ketoconazole, were also analyzed. The homozygous mutant was more resistant to Tunicamycin and Caspofungin but more sensitive to Amphotericin B, Ketoconazole, Fluconazole and Posaconazole than the parental strain. The null mutant showed a reduced virulence, in a murine model than the parental strain, evidencing that the presence of Pga26 is important to the virulence of C. albicans. Transcriptional profiling studies of pga26/pga26 revealed that the absence of Pga26 almost does not alter the expression of other genes, under the studied conditions.