Transthyretin familial amyloid polyneuropathy: novel therapeutics derived from drug repurposing and new insights in diagnosis through proteomic analysis of clinical samples

Abstract

La transtirretina (TTR) és una proteïna tetramèrica amiloidogènica (55 kDa) present al plasma humà i responsable del transport de la hormona T4 i del retinol a través de la proteïna d’unió a retinol (RBP). La proteïna TTR està associada amb diverses amiloïdosis, concretament la polineuropatia amiloide familiar (FAP), la cardiomiopatia amiloide familiar (FAC) i l’amiloïdosi senil sistèmica (SSA). La variabilitat associada a la TTR es deu tant a mutacions puntuals al gen codificant per aquesta com a modificacions post-traduccionals (PTMs) al residu Cys-10. Les PTMs més comuns associades a la Cys-10 de la TTR són la S-Sulfonació (S-Sulfo), la S-Glicinilcisteinilació (S-CysGly), la S-Cisteinilació (S-Cys) i la S-Glutationilació (S-GSH). Es creu que dites PTMs associades a la Cys-10 podrien jugar un paper biològic important en l’inici i procés patològic de les diferents amiloïdosis lligades a TTR. Hem tractat les amiloïdosis lligades a TTR des de dues perspectives diferents i) Intervencions terapèutiques i ii) Diagnòstic i monitorització de FAP. Referent a la primera part del projecte, hem portat a terme el cribratge de 41 possibles inhibidors de fibril·logènesis seleccionats mitjançant estratègies bioinformàtiques de repurposing de fàrmacs. Com a resultat de l’estudi, s’han trobat 4 nous estabilitzadors del tetràmer de TTR i, per tant, nous candidats pel tractament d’amiloïdosis lligades a TTR. Pel que fa a l’aproximació diagnòstica d’aquest treball, hem desenvolupat una metodologia per a la quantificació de PTMs en mostres de sèrum, així com per a la determinació dels nivells de TTR en aquest, tant en individus sans (wt) com en individus portadors de TTR amiloïdogènica (mutació V30M). Dita metodologia consisteix en una primera etapa d’enriquiment en TTR mitjançant immunoprecipitació, seguit de l’anàlisi de la TTR per espectrometria de masses de i) la proteïna intacta i ii) els pèptids de TTR portadors de les PTMs d’interès mitjançant l’anàlisi dirigit per LC-MS. L’anàlisi de les mostres de sèrum per la combinació d’ambdues estratègies aporta informació sobre la quantificació relativa i absoluta de les diferents PTMs presents a la TTR. Ha sigut possible mostrar que els mètodes basats en proteïna intacta es troben esbiaixats per algunes de les PTMs, donat que assumeixen un factor de resposta constant per les diferents isoformes. Contràriament, el nou mètode de LC-MS dirigit permet la quantificació absoluta de les diferents PTMs i els nivells totals de TTR (wt i mutant). La metodologia reportada ha sigut aplicada en l’anàlisi de dos grups de mostres clíniques. Com a resultat de l’estudi de mostres humanes de pacients de FAP en els diferents estadis de la malaltia, suggerim de forma preliminar les isoformes S-GSH i S-CysGly com a biomarcadors de progressió de la malaltia, permetent la diferenciació entre pacients en estadi 0 i 1 i, per tant, indicant l’aparició de la malaltia. Mitjançant l’anàlisi de mostres de pacients de FAP a diferents temps després de sotmetre’s a un transplantament de fetge (LT) i de pacients receptors de transplantament de fetge dominó provinent d’individus portadors de la mutació V30M, hem caracteritzat la progressió de la relació wt:V30M, així com l’evolució dels nivells de PTMs a la Cys-10, des de la intervenció fins a 9 anys després. Addicionalment, hem observat diferències significatives en els nivells de S-GSH i S-CysGly en comparar pacients de LT i DLT, resultats anàlegs als obtinguts en la comparació d’individus wt (sans) i pacients de FAP en estadi 0.

La transtirretina (TTR) es una proteína tetramérica amiloidogénica (55 kDa) presente en el plasma humano y la responsable del transporte de la hormona T4 y el retinol, a través de la proteína de unión al retinol (RBP). La proteína TTR está asociada con varias amiloidosis, concretamente la polineuropatía amiloide familiar (FAP), la cardiomiopatía amiloide familiar (FAC) y la amiloidosis senil sistémica (SSA). La variabilidad encontrada en la TTR se debe tanto a mutaciones puntuales encontradas en el gen que codifica para ésta como a modificaciones post-traduccionales (PTMs) en el residuo Cys-10. Las PTMs más comunes asociadas a la Cys-10 de la TTR son la S-Sulfonación (S-Sulfo), la S-Glicinilcisteinilación (S-CysGly), la S-Cisteinilación (S-Cys) y la S-Glutationilación (S-GSH). Se cree que dichas PTMs asociadas a la Cys-10 podrían jugar un papel biológico importante en el inicio y proceso patológico de las distintas amiloidosis ligadas a TTR. Hemos abordado las amiloidosis ligadas a TTR desde dos perspectivas distintas i) Intervenciones terapéuticas y ii) Diagnóstico y monitorización de FAP. Respecto a la primera parte del proyecto, hemos llevado a cabo el cribado de 41 posibles inhibidores de fibrilogenesis seleccionados mediante estrategias bioinformáticas de repurposing de fármacos. De este modo, se han encontrado 4 nuevos estabilizadores del tetrámero de TTR y por tanto, nuevos candidatos para el tratamiento de amiloidosis ligadas a TTR. En relación a la aproximación diagnóstica de este trabajo, hemos desarrollado una metodología para la cuantificación de PTMs en muestras de suero, así como para la determinación de los niveles de TTR en éste, tanto en individuos sanos (wt) como en individuos portadores de TTR amiloidogénica (mutación V30M). Dicha metodología consiste en una primera etapa de enriquecimiento en TTR mediante immunoprecipitación, seguido por el análisis de ésta mediante espectrometría de masas de i) la proteína TTR intacta y ii) de los péptidos de TTR portadores de las PTMs de interés mediante análisis dirigido por LC-MS. El análisis de muestras de suero mediante la combinación de ambas estrategias aporta información sobre la cuantificación relativa y absoluta de las distintas PTMs en TTR. Ha sido posible mostrar que los métodos basados en proteína intacta se encuentran sesgados para algunas de las PTMs, dado que asumen un factor de respuesta constante para las distintas isoformas. Por el contrario, el nuevo método de LC-MS dirigido permite la cuantificación absoluta de las distintas PTMs y los niveles totales de TTR (wt y mutante). La metodología reportada ha sido aplicada en el análisis de dos grupos de muestras clínicas. Como resultado del estudio de muestras humanas de pacientes de FAP en los distintos estadios de la enfermedad, sugerimos de forma preliminar las isoformas S-GSH y S-CysGly como biomarcadores de progresión de la enfermedad, permitiendo la diferenciación entre pacientes en estadio 0 y 1 y, por lo tanto, indicando la aparición de la enfermedad. Mediante el análisis de muestras de pacientes de FAP a distintos tiempos después de someterse a un trasplante de hígado (LT) y de pacientes receptores de trasplante de hígado dominó proveniente de individuos portadores de la mutación V30M, hemos caracterizado la progresión del ratio wt:V30M así como la evolución de los niveles de PTMs en la Cys-10, des de la intervención hasta 9 años después. Adicionalmente, hemos observado diferencias significativas en los niveles de S-GSH y S-CysGly en comparar pacientes de LT y DLT, resultados análogos a los obtenidos en la comparación de individuos wt (sanos) y pacientes de FAP en estadio 0.

Transthyretin (TTR) is an amyloidogenic tetrameric protein (55kDa) present in human plasma, transporting T4 hormone and retinol, through the retinol binding protein (RBP). TTR is associated with several amyloidosis, namely familial amyloidotic polyneuropathy (FAP), familial amyloidotic cardiomyopathy (FAC) and senile systemic amyloidosis (SSA). Variability of TTR is not only due to point mutations in the encoding gene but also to post-translational modifications (PTMs) at Cys-10, the most common PTMs being the S-Sulfonation (S-Sulfo), S-Glycinylcysteinylation (S-CysGly), S-Cysteinylation (S-Cys) and S-Glutathionylation (S-GSH). It is thought that PTMs at Cys-10 may play an important biological role in the onset and pathological process of amyloidosis related to TTR. We have aimed TTR amyloidosis from two different perspectives i) Therapeutic interventions and ii) FAP diagnosis and monitoring. Regarding the first branch of the project, we have performed the screening of a library of 41 possible fibrillogenesis inhibitors selected by a bioinformatic repurposing workflow, finding 4 new TTR tetramer stabilizers and thus, new potential candidates for TTR amyloidosis treatment. Concerning the clinical approach of this work, we have developed a methodology for quantification of PTMs in serum samples, as well as for the determination of serum TTR levels, from healthy (wt) and TTR-amyloidotic (V30M mutation) individuals. It involves an enrichment step by immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis of (i) the intact TTR protein and (ii) targeted LC-MS analysis of peptides carrying the PTMs of interest. Analysis of serum samples by the combination of the two methods affords complementary information on the relative and absolute amounts of the selected TTR PTM forms. It is shown that methods based on intact protein are biased for specific PTMs since they assume constant response factors, whereas the novel targeted LC-MS method provides absolute quantification of PTMs and total TTR variants. The reported methodology has been applied to two different sets of clinical samples. As a result of the study of human samples of FAP patients at different disease stages, we preliminary pointed out S-GSH and S-CysGly isoforms as biomarkers of disease progression, allowing the differentiation between FAP stage 0 and 1 and therefore indicating disease onset. Through the analysis of a time series from FAP patients having undergone liver transplantation (LT) and from domino liver transplantation (DLT) recipients from V30M carriers, we have characterized the progression of the wt:V30M ratios, as well as the evolution of the Cys-10 PTMs, from transplantation and up to 9 years after. Additionally, we have observed significant differences in the levels of S-GSH and S-CysGly when comparing liver and domino liver transplanted patients, analogous to the results obtained in the comparison of wt individuals and FAP stage 0 patients.