Glicogen sintasa muscular: elements de control de la distribució subcel·lular i identificació de residus crítics per a la catàlisi.

Abstract

La glicogen sintasa muscular és un enzim altament regulat. Aquesta tesi doctoral ha aprofondit en diversos aspectes no resolts com la descripció del seu mecanisme catalític i les relacions estructura-funció o la distribució subcel·lular de l'enzim. Així doncs aquesta tesi doctoral ha combinat diferents tècniques, ja siguin bioinformàtiques, bioquímiques i de biologia cel·lular i molecular i els resultats obtinguts es resumeixen en els següents paràgrafs.<br/> <br/>Els resultats de la comparació de les glicogen (midó) sintases i les glicogen sintases indiquen que a més de catalitzar la mateixa reacció, la síntesi de ?(1?4)-glucà, comparteixen característiques similars així com zones d'estructura secundària predita homòlogues. Per tant podrien incloure's en una mateixa "superfamília".<br/><br/>A més es detectà que les glicogen (midó) sintases d'arqueobacteris són filogenèticament properes a les glicogen sintases de fongs i mamífers. Endemés d'ésser similars a nivell de seqüència i estructura secundària predita presenten una especificitat de substrat semblant i una mida més reduïda. Per tant són bons models per a estudiar a nivell estructural tant les glicogen sintases com les glicogen (midó) sintases.<br/><br/>També s'ha demostrat que el residu Glu-510 de la HsMGS és essencial per a la catàlisi i el Glu-518 hi juga un paper important però secundari. Proposem que els equivalent d'aquests residus en les glicosiltransferases de les famílies 4, 5, i 15 també són fonamentals en el mecanisme de catàlisi.<br/><br/>La glicogen sintasa muscular de mamífers presenta una localització subcel·lular regulada entre el nucli i el citoplasma. Aquesta translocació no és exclusiva de l'enzim humà ni de les cèl·lules de tipus muscular ja que també es presenta la línia cel·lular 3T3-L1, un model d'adipòcits de ratolí. Ni la sobreexpressió ni la fusió de l'enzim a GFP alteren aquesta distribució regulada. Endemés quan se sobreexpressa la glicogen sintasa muscular en cèl·lules que no la expressen també es manté la distribució regulada.<br/><br/>De diferents experiments de mutagènesi dirigida també s'ha observat que la glucosa 6-fosfat juga un paper estimulador en l'export des del nucli de la HsMGS. L'augment de la concentració de glucosa 6-fosfat és necessaria per afavorir la seva localització correcta a l'hora de sintetitzar glicogen, per tal de fornir de substrat i per activar a la glicogen sintasa.<br/><br/>La concentració de la HsMGS en el nucli es produeix en resposta a la depleció del glicogen intracel·lular. El glicogen realitzaria una funció de retenció de la proteïna en el citoplasma impedint-ne la seva translocació al nucli.<br/><br/>Dins del nucli la HsMGS forma agregacions esfèriques que es distribueixen pel nucleoplasma. Aquestes agrupacions col·localitzen amb p80-coilina i PML. <br/><br/>La capacitat de l'enzim de catalitzar la síntesi de l'?(1?4)-glucà no és necessària per al control de la localització subcel·lular, ja que el mutant Glu-510 (catalíticament incapaç) es distribueix en la cèl·lula de la mateixa forma que l'enzim salvatge.<br/><br/>La fosforilació i desfosforilació dels llocs descrits que controlen l'activitat de la HsMGS no regulen la distribució subcel·lular d'aquest enzim. Malgrat això, existeixen certes evidències que d'altres residus no identificats es fosforilen, i tenint en compte que el transport nucleocitoplasmàtic es regula molt freqüentment mitjançant fosforilació-desfosforilació, seria possible que aquests nous llocs controlessin en alguna mesura la translocació de la HsMGS.<br/><br/>Finalment també s'ha demostrat que l'export nuclear de la HsMGS està mediat per la via clàssica d'export, que és leptomicina B sensible.