Papel de la endocitosis mediada por clatrina y de la proteína SPARC sobre la plasticidad sináptica

Abstract

Desde que se establecen las sinapsis hasta que son plenamente maduras, experimentan diversos cambios. En el terminal presináptico, a nivel morfológico se produce un rellenado progresivo del número de vesículas sinápticas que modificará las propiedades funcionales de las sinapsis. La disponibilidad de vesículas es necesaria mantener la neurotransmisión en períodos de actividad y la endocitosis es el mecanismo encargado de reformar las vesículas que han sido previamente liberadas. Sin embargo, es >1000 veces más lenta que la exocitosis, convirtiéndose en el factor limitante de la neurotransmisión.

Además, en el contexto in vivo, las sinapsis están rodeadas de otros tipos celulares, como la glía, que pueden sentir y modificar las propiedades sinápticas mediante la secreción de factores. En esta tesis, se ha empleado un sistema de microcultivos conocidos como single-cell microcultures (SCM) establecidos a partir de neuronas del ganglio cervical superior de rata. Así, una neurona única crece formando contactos sinápticos colinérgicos con ella misma, siendo a su vez presináptica y postsináptica y permitiendo el registro de la actividad sináptica con un sólo electrodo. Además, como las neuronas se desarrollan en ausencia de glía, se puede estudiar el efecto de factores gliales sobre la neurotransmisión, añadiéndolos al medio de cultivo. Tras el registro de las neuronas, se realiza un estudio correlativo de microscopía de inmunofluorescencia ó microscopía electrónica. Los resultados de esta tesis demuestran que las sinapsis pueden establecerse y desarrollarse en ausencia de glía. Tras el comienzo de la neurotransmisión (.13 d.i.v.), las sinapsis son inmaduras y presentan una disminuida respuesta sináptica, una marcada depresión a corto plazo y un reducido tamaño de los depósitos de vesículas de liberación. Con la maduración se producen cambios debido al incremento de los depósitos de vesículas. In vitro, los cambios ocurren en las mismas sinapsis que se establecieron inicialmente, ya que no se observan variaciones en el número de contactos sinápticos. Sin embargo, in vivo el número de sinapsis que se forman en un principio es superior a aquéllas que finalmente se consolidan y maduran. Es decir, existe un proceso de refinado y eliminación sináptica que debe desencadenarse por factores externos. En esta tesis se ha encontrado que Secreted protein acidic and rich in cystein (SPARC), una proteína matricelular de origen glial secretada durante el desarrollo, es capaz de ejercer un efecto dosis dependiente sobre el desarrollo sináptico. <10 nM, reduce los depósitos presinápticos de vesículas, arrestando a las sinapsis en un fenotipo de inmadurez. >10 nM desencadena un proceso de eliminación sináptica, mediante una endocitosis masiva de la superficie plasmática y la generación de cuerpos endosomales degradados vía lisosomal. Los resultados se corroboran in vivo, inyectando la proteína en la cola del renacuajo de Xenopus tropicalis provocando la eliminación de las uniones neuromusculares.

Paralelamente, en SCMs plenamente funcionales, se ha observado que una intensa actividad también favorece la reducción de la cantidad y la calidad de las vesículas sinápticas, que se manifiesta en una incapacidad para mantener la neurotransmisión. Asumiendo que la endocitosis mediada por clatrina es el principal mecanismo de reciclaje de las sinapsis, y clatrina es la proteína más específica del mecanismo, se estudió el comportamiento de esta proteína durante períodos de estimulación. Se observó que clatrina sale de las sinapsis hacia las regiones perisinápticas. Usando lentivirus para reducir la expresión de clatrina (shRNA), se observaron resultados funcionales similares a los obtenidos en períodos de alta estimulación: una reducción del número de vesículas y un menor contenido de neurotransmisor. Este fenotipo fue rescatado dializando clatrina exógena purificada en la pipeta de registro.

Así, clatrina y SPARC, son factores importantes para el desarrollo y la plena funcionalidad de las sinapsis.

The required mechanisms that regulate synaptic maturation are not deeply known, although the presynaptic changes such as a high number of synaptic vesicles and the grouping of these at the active zone, are well-characterized features. It is believed that these changes are mediated by neurotrophins or glial molecules. After the synaptogenic period, non-functional synapses tend to disappear. Although, the factors involved in synapses elimination are not known, it is suggested that glia triggers it.

In functional neurons, to maintain communication, synapses must recycle their released vesicles with high efficiency. In this process mainly participates the clathrin-mediated endocytic machinery, but the consequences of this are poorly understood.

Thus, in this dissertation, synaptic plasticity has been studied based on the degree of maturity and the effect of endocytosis capacity. We made use of a cholinergic microculture model, called Single-cell microculture (SCM) established from rat superior cervical ganglion neurons in the absence of glia. SCMs provide a good model to study synaptic function because a given neuron is both presynaptic and postsynaptic. Furthermore, SCMs permit to study the effect of glial factors on neurotransmission, by adding them on the culture medium. We have found that SPARC, a secreted protein by glia during development, triggers a cell-autonomous program of synapse elimination in SCMs. The loss of synaptic contacts is associated to the formation of retracted axon terminals, containing multivesicular bodies and secondary lysosomes. The biological relevance of culture results is supported by injecting the tail of Xenopus tropicalis tadpoles with SPARC. Swimming is severely impaired, caused by the massive elimination of neuromuscular junctions.

On the other hand, we have found that the amount of clathrin in a presynaptic terminal is not fixed. During stimulation, clathrin moves out of synapses as a function of stimulus strength and neurotransmitter release probability. Correlative functional and morphological experiments show that presynaptic synaptic transmission is compromised if clathrin levels fall by 20% after clathrin heavy chain knock down using RNAi. However, synaptic depression reverts after dialysis of exogenous clathrin, thus compensating RNAi-induced depletion.

Together, our results show that clathrin levels and SPARC actively affect synaptic plasticity during development.