Oocyte maturation and embryo development in sheep: effect of biomolecular polyunsaturated fatty acids and hyaluronan

Abstract

La calidad o competencia del oocito se define por su capacidad para ser madurado, fecundado y dar lugar a una gestación normal y a un parto con un nacimiento sano. .La producción in vitro de embriones (PIVE)s posibilita la obtención de un gran número de embriones de una hembra seleccionada. Utilizar oocitos de hembras prepúberes para la PIVE permite acortar el intervalo generacional y de esta forma intensificar la selección genética en los programas de mejora animal. Sin embargo los oocitos de hembras prepúberes son obtenidos de folículos pequeños y son oocitos de menos calidad para formar embriones in vitro. En estudios anteriores en nuestro laboratorio observamos que la calidad del oocito está mas relacionada con el tamaño del folículo del cual provienen que de la edad de la hembra. Así observamos el mismo porcentaje de embriones producidos in vitro en oocitos de cabras prepúberes (30 a 45 días de edad) obtenidos de folículos mayores de 3mm que de oocitos de cabras adultas. LA conclusión a la que se llega es que la calidad y competencia del oocito está estrechamente relacionada con el desarrollo folicular y la composición del liquido folicular del cual proviene. En vacuno se han realizado varios estudios en los que se relaciona la fertilidad de las vacas con su dieta rica en grasas no saturadas. También los grasos poli insaturados son los ácidos grasos que se encuentran en mayor concentración en el líquido folicular. Entre estos ácidos grasos los que más atención y estudios han conseguido son el Acido Linoleico (AL) y el acido Linolenico (ALA) de las familias omega 6 y omega 3, respectivamente. Ambos ácidos han demostrado su efecto sobre la calidad de los oocitos in vivo e in vitro. Las hembras prepúberes tiene una composición corporal pobre en grasa y presumiblemente también su liquido folicular tenga baja concentración en ácidos AL y ALA. Así uno de los objetivos de este trabajo de tesis ha sido estudiar el efecto de la adicción de diferentes concentraciones de AL y ALA en los medios de maduración in vitro de oocitos de corderas sobre su desarrollo embrionario in vitro. El Acido Hialurónico (AH) es un polisacárido con largas cadenas de azucares que se encuentra en la matriz extracelular e intracelular de los tejidos animales. El AH se encuentra como un glicosaminoglicano (GAG) en el tracto reproductivo de las hembras: úteros, oviducto y liquido folicular. Además se ha demostrado que el AH juega un papel importante retrasando la muerte por fragmentación de los oocitos porcinos. En vacuno, la adición del AH ha mejorado la producción in vitro de blastocistos y añadido en los medios de crioconservación también ha mejorado la supervivencia de los embriones crioconservados. El siguiente objetivo de este trabajo es añadir AH en los medios de cultivo embrionario con el objetivo de incrementar el desarrollo hasta blastocisto de los cigotos de corderas producidos in vitro y su resistencia a la crioconservación. Con estos objetivos se han realizado 3 estudios: 1) Efecto del Acido Linolenico (ALA) sobre la maduración del oocito y su desarrollo embrionario en oocitos de oveja prepúber.2) Efecto del Acido Linoleico (AL) sobre la maduración del oocito y su desarrollo embrionario en oocitos de ovejas prepúberes y 3) Efecto del Acido Hialuronico de alto peso molecular sobre el desarrollo a blastocisto y su resistencia a la crioconservación. En el Experimento 1, se añadió al medio de Maduración in vitro (MIV) de oocitos de corderas concentraciones 50, 100 y 200 µM de Acido Linolenico (ALA) y se estudió su efecto sobre la maduración nuclear, la expansión del cumulus, la secreción de prostaglandinas E2 y F2α, estradiol, progesterona y el porcentaje de oocitos que alcanzaban el estadio de blastocistos. Estos resultados se compararon con un grupo control que no llevaba ALA. Los resultados de este experimento demostraron que a concentraciones 200 µM la maduración del oocito y la expansión del cumulus disminuían comparado con los otros grupos (P≤0.05). La adición de ALA incrementaba la secreción de ambas prostaglandinas analizadas después de las 24 h de maduración de los oocitos (P≤0.05). No se observaron diferencias en el porcentaje de blastocistos obtenidos entre el grupo control (12.2%) y los grupos de 50, 100 y 200 µM ALA (6.9, 11.5 y 14.0%, respectivamente). Sin embargo si que hubo diferencias en el total de células por blastocisto (46.50±5.85, 67.94±6.71, 45.20±6.37, y 59.80±5.51, respectivamente, P≤0.05) y en el total de células apoptoticas por blastocisto (6.45±0.89, 2.48±0.81, 4.02±1.15, y 3.67±1.15, respectivamente, P≤0.05). Después de la MIV la concentración de E2 fue mas baja y la de P4 mas alta en los grupos con ALA que en el grupo control (P≤0.05). En conclusión, estos resultados indican que la adición de ALA al medio de MIV han afectado la calidad de los blastocistos producidos y alterado la liberación de hormonas reproductivas En el experimento 2, se añadió al medio de MIV concentraciones de 50, 100 and 200 µM de Acido Linoleico (LA) y se estudiaron los mismos parámetros que en el experimento 1. Los resultados de este experimento no demostraron ningún cambio en el número de oocitos que alcanzaban la metafase II. La producción de PGE2 y PGF2α incrementó en todos los grupos de AL comparados con el control (P≤0.05). La relación PGE2/PGF2α tampoco fue alterada. Después de la FIV el grupo con 50 µM de AL presentaba un porcentaje de cigotos correctamente fertilizados (2PN) superior al control (57.89 vs. 45.45, respectivamente, P≤0.05). No se observaron diferencias en el porcentaje de blastocistos obtenidos. Sin embargo la calidad de los blastocistos fue superior en el grupo de 50 µM con un número total de células por blastocisto superior al control (63.88±4.54 vs. 53.35±3.64, P≤0.05, respectivamente). No hubo diferencias en el número de células apoptoticas. La producción de E2 fue menor en los grupos AL y no hubo diferencias en la producción de P4. En conclusión, la adición de LA no ha afectado la maduración nuclear ni la producción de blastocistos, sin embargo dosis bajas de LA han incrementado el porcentaje de cigotos normales con 2 pronucleos y la calidad de los blastocistos evaluada por el número total de células. En el experimento 3, concentraciones de 0.25, 0.5 y 1 mg/ml de Acido Hialuronico (AH) fue añadido al medio de cultivo de los embriones producidos en in vitro con oocitos de corderas. El medio de cultivo se preparó sin suero. Los embriones de 2-4 células se cultivaron durante 7 días. Los resultados que se obtuvieron fueron que el porcentaje de blastocistos obtenidos con las distintas concentraciones de AH (33±5.7%, 32±6.0%, 35±5.5%, respectivamente) y el porcentaje de supervivencia embrionaria después de la vitrificación (63±17.1%, 83±15.2%, 58±14.2%; respectivamente) fue estadísticamente superior (P≥0.05) al grupo control (25±5.2%, 38±17.1%, respectivamente). Además, la adicción de AH aumentó el número total de células por blastocisto (83.6±4.6, 100.7±3.8, 97.2±3.7, 105.0±3.9; respectivamente, P<0.05) y el número de células de trofoectodermo ((58.4±3.8, 74.2±3.2, 75.6±3.3, 80.1±3.4; respectivamente, P<0.05). Los embriones que sobrevivieron a la vitrificación también presentaron mayor número de células totales (63.2±3.7, 130.8±3.6, 113.9±5.2, 149.8±5.4; P<0.05), del trofoectodermo (42.9±3.0, 96.7±3.1, 85.2±4.5, 111.9±4.7; P<0.05) y del botón embrionario (20.3±2.2, 32.9±1.8, 27.7±2.6, 36.5±2.7; P<0.05) los blastocistos cultivados con AH que los del grupo control. En conclusión, con oocitos de corderas de 3 meses de edad, aproximadamente, la utilización de AL, ALA en el medio de MIV y de AH en el medio de cultivo no ha incrementado el porcentaje de blastocistos obtenidos. Sin embargo, los ácidos grasos LA y ALA han mejorado la calidad de los embriones aumentando su número de células y el AH ha mejorado la calidad de los blastocistos y mejorado su resistencia a la vitrificación.

The prepubertal sheep ovaries have a large number of small follicles containing oocytes with a capability of developing to upper stages of nuclear maturation, cleaving subsequent post insemination and finally being a blastocyst, that can be transferred to surrogate ewes for progressing of animal breeding programs. Whereas, it has shown that oocytes from prepubertal animals have low competence to develop to higher stages. Accordingly, in this study we have tried to do experiments to improve this deficiency by using Alpha linolenic acid (ALA) and Linoleic Acid (LA). Also, we have tried to improve survival of sheep embryos cultured in vitro using Hyaluronan (HA). Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) have shown to have beneficial effects on oocyte maturation and embryo development in vivo and in vitro conditions. Also, PUFAs constitute the major portion of the fatty acid content of the follicular fluid in small and large follicles. ALA and LA from PUFAs used in the present study in 2 separate experiments (experiment 1 for ALA and experiment 2 for LA). To our knowledge there are no previous reports using ALA and LA in prepubertal sheep oocytes in vitro. We used in three concentrations (50, 100 and 200µM) of ALA and LA in maturation media. Subsequently, we evaluated parameters such as cumulus cell expansion, nuclear maturation, secretion of prostaglandins (PGE2 and PGF2α) and steroids (E2 and P4), two pro-nuclei, polyspermy, asynchrony, cleavage, blastocyst rate and embryo quality via counting total cell number and apoptotic cells. In experiment 1, oocytes nuclear maturation and the number of fully expanded cumulus cells were reduced in 200 µM ALA treatment compared to other groups (P≤0.05). Supplementation with ALA increased both PGE2 and PGF2α concentration in the spent media (P≤0.05). No differences were observed in blastocyst development among control (12.2%) and 50, 100 and 200 µM ALA groups (6.9, 11.5 and 14.0%, respectively). However, total cells (46.50±5.85, 67.94±6.71, 45.20±6.37, and 59.80±5.51, respectively, P≤0.05) and apoptotic cell number (6.45±0.89, 2.48±0.81, 4.02±1.15, and 3.67±1.15, respectively, P≤0.05) were significantly improved. After IVM, E2 concentration was lower and P4 concentration was higher in ALA groups compared to control (P≤0.05). In conclusion, these results showed that ALA affects prepubertal sheep embryo quality associated with alteration of releasing reproductive hormones. In experiment 2, no changes were observed in the number of oocytes achieving MII nuclear maturation (91.8, 91.6, 87.9, 93.1 and 93.1, respectively). Production of PGE2 and PGF2α increased in all LA concentrations compared to control (P≤0.05). The ratio of PGE2/PGF2α was not altered. LA at 50µM significantly improved the rate of 2 pro-nuclear (2PN) compared to control (57.89 vs. 45.45, respectively, P≤0.05). There were no differences in cleaved embryos and blastocyst rates. However, embryo quality was improved by 50µM of LA with increase in total cell numbers compared to control (63.88±4.54 vs. 53.35±3.64, P≤0.05, respectively). There was no difference in apoptotic cell numbers. Also, production of E2 decreased significantly while there were not differences in P4 production and the rate of E2/P4 ratio. In conclusion, LA supplementation to prepubertal sheep oocytes in IVM media negatively altered the fully expanded cumulus cells significantly without inhibition of MII nuclear stage percentage of oocytes. The results from the present study provide evidence in increased number of zygotes with normal 2PN and also showed beneficial effects of low level LA on embryo quality of blastocysts at 8 day of post insemination in serum free media. HA is a polysaccharide with long polymer chains of sugars and has found in the extracellular matrix and intercellular matrix of animal tissues. HA is found enormously as a plentiful Glycosaminoglycan (GAG) in the female reproductive tract like uterus, oviduct and follicular fluids. Furthermore, it has been illustrated that HA plays a role in introducing a delay of death in the oocyte with preventing of oocyte from fragmentation in porcine. Also HA improves in vitro produced bovine embryos to develop to the blastocyst stage. It has also been indicated that embryo cryo-survival improvement is due to the HA added to cryopreservation medium HA numerically increased blastocyst percentage at 7-day (33±5.7, 32±6.0, 35±5.5; P≥0.05) and survival rates 48 h after culture in serum free media (63±17.1, 83±15.2, 58±14.2; P≥0.05) as compared to the respective controls (25±5.2, 38±17.1). It increased the total cell (TC) number (83.6±4.6, 100.7±3.8, 97.2±3.7, 105.0±3.9; P<0.05) and trophectoderm cells (TE) (58.4±3.8, 74.2±3.2, 75.6±3.3, 80.1±3.4; P<0.05) at 7-day embryos. Survived embryos had higher TC (63.2±3.7, 130.8±3.6, 113.9±5.2, 149.8±5.4; P<0.05), TE (42.9±3.0, 96.7±3.1, 85.2±4.5, 111.9±4.7; P<0.05) and ICM (20.3±2.2, 32.9±1.8, 27.7±2.6, 36.5±2.7; P<0.05). The results indicate that HA improves the embryo development and viability even quality which might have implication for improving embryo transfer.