Infección peritoneal postoperatoria y recurrencia del cáncer colorrectal: estudio de la capacidad de proliferación, migración e invasión de células tumorales in vitro como mecanismos responsables de esta asociación

Abstract

La dehiscencia de anastomosis después de cirugía de cáncer colorrectal (CCR) se asocia a una mayor recurrencia tumoral. Sin embargo, los mecanismos responsables de esta asociación son aún desconocidos. En un trabajo previo demostramos que la respuesta inflamatoria y angiogénica secundaria a la infección peritoneal tras cirugía de CCR es mayor que en los pacientes que no presentan ninguna complicación postoperatoria. Esta respuesta amplificada podría tener un efecto negativo en los pacientes con CCR. Otro de los mecanismos que podría explicar esta asociación sería la adquisición de un fenotipo invasivo de células tumorales residuales en presencia de infección. El primer objetivo de este proyecto de investigación fue confirmar nuestros resultados previos y ampliar el estudio a otras citoquinas inflamatorias y angiogénicas. En segundo lugar, investigamos el efecto de la infección peritoneal tras cirugía de CCR sobre la proliferación, migración e invasión de líneas celulares de cáncer in vitro. Se realizó un estudio prospectivo de cohortes con controles apareados en pacientes intervenidos de CCR con intención curativa. Los pacientes que presentaron un absceso intraabdominal o una dehiscencia anastomótica fueron incluidos en el grupo infección. También se seleccionó otro paciente sin ninguna complicación postoperatoria para el grupo control. Las variables de apareamiento fueron sexo, edad, localización tumoral, abordaje quirúrgico, estadio tumoral y tratamiento neoadyuvante en los pacientes con cáncer de recto. Se obtuvieron muestras de sangre y líquido peritoneal antes de la cirugía y al cuarto día postoperatorio o en el momento del diagnóstico de la infección. Se analizaron 43 citoquinas inflamatorias y angiogénicas en las muestras de suero postoperatorias mediante arrays de anticuerpos. Los ensayos in vitro consistieron en el cultivo de células tumorales MDA-MB-231 y SW620 que se trataron con muestras de suero y líquido peritoneal preoperatorias y postoperatorias. Los ensayos de proliferación, migración e invasión realizados se basaron en el método colorimétrico en el cual se utiliza la actividad de la enzima hexosaminidasa como cuantificación del número de células viables. Durante el periodo de estudio, 47 pacientes fueron incluidos en el grupo infección con sus correspondientes controles. Todas las citoquinas analizadas fueron significativamente mayores en el grupo infección. Las muestras de suero postoperatorias de pacientes del grupo infección mostraron un aumento significativo de la proliferación de células MDA-MB-231. Este efecto fue más evidente cuando comparamos la diferencia de proliferación entre muestras postoperatorias y preoperatorias, entre grupos. Además, observamos una mayor inducción de la migración celular en el grupo infección al aplicar muestras de suero postoperatorio aunque no encontramos diferencias de actividad celular invasiva entre grupos. No hallamos diferencias de proliferación celular entre grupos al tratar las células con muestras de líquido peritoneal postoperatorias. Sin embargo, algunas de estas muestras mostraron un efecto citotóxico no relacionado con la presencia de infección. Las muestras postoperatorias de líquido peritoneal del grupo infección mostraron un incremento significativo de la migración de células MDA-MB-231 y de la invasión de células SW620. Este efecto también se observó al comparar las diferencias entre muestras postoperatorias y preoperatorias entre ambos grupos. La supervivencia libre de enfermedad fue significativamente menor en el grupo infección. La infección peritoneal postoperatoria se asoció a recurrencia tumoral. El riesgo de padecer una recurrencia tumoral fue casi tres veces mayor si se sufrió una infección peritoneal postoperatoria en nuestra muestra de pacientes. En conclusión, la expresión de citoquinas inflamatorias y angiogénicas después de cirugía de CCR es mayor en presencia de infección peritoneal. La infección peritoneal postoperatoria estimula la proliferación, migración e invasión de las células tumorales in vitro. Estos mecanismos podrían ser responsables, al menos en parte, de la asociación entre la infección peritoneal y la recurrencia tumoral tras la cirugía del CCR.

Anastomotic leakage after colorectal cancer (CRC) surgery is associated with higher tumor recurrence. However, the mechanisms responsible for this association are unknown. In a previous study we showed that inflammatory and angiogenic responses after CRC surgery were higher in patients with postoperative infection than in patients with no postoperative complication. A magnification of these responses could enhance a negative effect in patients with cancer. Another mechanism that would explain this association might be the acquirement of an invasive phenotype of residual tumor cells in the presence of peritoneal infection. The aim of this study was to confirm our previous results and extend the study to other inflammatory and angiogenic cytokines; and investigate the effect of postoperative peritoneal infection after CRC surgery on proliferation, migration, and invasion capacities of tumor cells in vitro. We performed a prospective cohort study with matched controls of patients who underwent elective surgery for CRC with curative intent. Patients who had an intra-abdominal abscess or an anastomotic leak were included in the infection group. For each patient with infection another patient with an uncomplicated postoperative course was selected for the control group. Controls were matched for gender, age, tumor location, surgical approach, tumor stage and neoadjuvant therapy in patients with rectal cancer. Blood and peritoneal fluid samples were collected before surgery and on postoperative day 4 or at the moment a peritoneal infection was diagnosed. We analyzed 43 different inflammatory and/or angiogenic cytokines in the sera of these patients with antibody arrays. In vitro assays on cancer cell lines (MDA-MB-231 and SW620) were performed using preoperative and postoperative serum and peritoneal fluid samples. The assays were performed according to the colorimetric method based on the activity of the lysosomal hexosaminidase enzyme as a measure of the number of viable cells. During the study period, 47 patients were included in the infection group: 34 patients developed an anastomotic leak and 13 patients an intraabdominal abscess. All cytokines tested were significantly induced in the infection group. Postoperative serum samples from patients with peritoneal infection significantly increased proliferation in the MDA-MB-231 cell line compared with controls. This effect was most apparent when comparing the increase in cell proliferation exerted by postoperatory samples respect to preoperatory samples within each group. We also observed a major induction of migration activity with the infection group postoperative serum samples. Cell invasion assays with serum samples did not reveal significant differences between groups. We found no differences in cell proliferation between both groups when cells were treated with peritoneal fluid samples. However, some postoperative peritoneal fluid samples exerted a cytotoxic effect on cell cultures that was not related to the presence of infection. Postoperative peritoneal fluids taken from the infection group rendered a significant increase in the capacity of MDA-MB-231 migration and SW620 invasion capacities. This effect was also apparent when comparing the difference activity between postoperative and preoperative samples in both groups. During follow-up, 12 patients developed tumor recurrence in the infection group and 6 in the control group. Cumulative disease-free survival was significantly lower in patients with postoperative peritoneal infection. The risk of tumor recurrence was almost three times higher if patients suffered a postoperative peritoneal infection in our sample. In conclusion, our results confirm that postoperative peritoneal infection induces a large number of serum cytokines. Furthermore, postoperative peritoneal infection enhances proliferation, migration and invasion capacities of tumor cells in vitro. These mechanisms might be responsible, at least in part, for the association between peritoneal infection and tumor recurrence after CRC surgery.