Funcionalidad de las poliaminas sobre el desarrollo del sistema inmune y la microbiota intestinal durante el periodo de lactancia : influencia del procesado de las fórmulas infantiles en el contenido en poliaminas y en la liberación de péptidos durante la digestión: ensayo de funcionalidad empleando como modelo ratones BALB/cOlaHsd lactantes= Polyamine functionality on immune system development and intestinal microbiota during lactation : influence of the infant formula manufacturing on polyamine content and bioactive peptide releasing during digestion: assay of functionality in a lactating BALB/cOlaHsd mice model

Abstract

Introducción: La lactancia materna es la forma de alimentación recomendada, siempre que sea posible, al menos durante los primeros seis meses de vida. Si esto no es posible, existen fórmulas artificiales con las que poder cubrir los requerimientos nutricionales de los recién nacidos. La exposición a determinados factores ambientales, incluidos factores nutricionales, durante el periodo intrauterino y los meses posteriores al nacimiento podría determinar la susceptibilidad a determinadas enfermedades en etapas posteriores de la vida. Se ha demostrado una menor susceptibilidad a determinadas enfermedades en niños alimentados con leche materna frente a aquellos que lo han sido con fórmulas infantiles, incluyendo menor riesgo de enfermedades gastrointestinales y respiratorias, y menor riesgo de obesidad y diabetes en la edad adulta. El hecho de que estos cambios se prolonguen hasta la edad adulta sugiere que la exposición temprana a factores nutricionales podría estar asociada a cambios epigenéticos. Las poliaminas son policationes orgánicos presentes en todas las células de mamíferos. Su interés es debido a su función, siendo esenciales para la proliferación y la diferenciación celular. Su presencia ha sido demostrada en la leche humana siendo las poliaminas más abundantes la espermidina y la espermina. Objetivos: El objetivo de la presente Tesis ha sido evaluar si la adición de poliaminas tras el procesado podría mejorar el desarrollo del sistema inmune y producir un patrón de colonización microbiana similar al obtenido mediante lactancia materna utilizando como modelo ratones BALB/cOlaHsd. Métodos: 60 crías de ratón de 14 días de edad fueron distribuidas aleatoriamente en cuatro grupos: 1) ratones sin destetar con lactancia normal; 2) ratones destetados precozmente alimentados con fórmulas infantiles; y 3) tres grupos distintos de ratones destetados precozmente alimentado con una fórmula infantil suplementada con concentraciones crecientes de poliaminas. Se analizó la microbiota intestinal mediante fluorescent in situ hybridization (FISH) y detección por citometría de flujo y PCR cuantitativa. Además, se analizaron poblaciones linfocitarias mediante citometría de flujo y la expresión de genes relacionados con la activación, proliferación y diferenciación de linfocitos T y B. Resultados y Conclusiones: En relación a la microbiota, nuestros resultado muestran, por primera vez que nosotros sepamos, que la suplementación de las fórmulas infantiles con poliaminas modula las poblaciones bacterianas de Bacteroides-Prevotella, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. y bacterias similares a Akkermansia, incluida A. muciniphila, hasta niveles parecidos a los del grupo alimentado con lactancia normal en un efecto que parece ser dependiente de la dosis de poliaminas administrada. De forma similar a lo que ocurría con la microbiota intestinal, la suplementación de la fórmula infantil con poliaminas induce cambios en las poblaciones linfocitarias y la expresión génica, incrementándose el porcentaje de linfocitos B en sangre, y linfocitos CD4+, CD8+ y B en bazo, en una proporción dependiente de la dosis de poliaminas; y reduce las diferencias en la expresión de los genes Cd1d1, Cd40, Hdac5, Hdac7, Clcf1 y Tlr4 cuando se compara con lactancia normal. Los resultados obtenidos de este estudio ayudan a comprender la compleja interrelación entre la nutrición, el sistema inmune y la microbiota intestinal durante el periodo de lactancia. Los resultados obtenidos deberían ser estudiados en humanos, ya que de demostrarse efectos similares, la suplementación de las fórmulas infantiles con poliaminas podría contribuir a un mejor desarrollo, con un efecto beneficioso sobre la salud, de niños alimentados con fórmulas.

Introduction: As has been recommended by a large number of health or breastfeeding organisations, whenever feasible, infants should be fully breastfed for at least six months. If full breastfeeding is not possible, safe and suitable infant formula should be used. According to the early programming theory, environmental exposure, including nutritional exposure during the intrauterine stage and during the perinatal months of life, might make children more susceptible to some diseases later in life. Indeed, it has been demonstrated that infants who have been breastfed have a lower susceptibility to some diseases than infants who were fed with artificial manufactured formulas. The fact that these changes are extended into adult life suggests than early exposure to nutritional factors are associated with epigenetic changes. Polyamines are organic polycations that are present in all mammalian cells. They have significant interest due to their reported biological roles in eukaryotic cells, because they are essential to cell proliferation and differentiation. Their presence has been demonstrated in human milk as being the most abundant spermidine and spermine polyamines. Objectives: the main objective of the present thesis was to evaluate whether the addition of polyamines after processing could improve immune system development and the microbial colonization pattern in a similar way that breast feeding do. Methods: A total of 60 mice pups (14-days old) were randomly assigned to four-day intervention groups as follows: 1) breastfed unweaned pups; 2) early weaned pups fed with infant formula; and 3) three different groups of early weaned pups fed with infant formula supplemented with increasing levels of polyamines. After a four-day diet intervention, samples were obtained. Microbiota composition was analysed by fluorescent in situ hybridization (FISH) coupled with flow cytometry detection, and by quantitative PCR targeted at 14 bacteria genus and species. The lymphocyte populations in the blood, spleen and mesenteric lymph nodes were analysed by fluorescence activated cell sorting (FACS); moreover, the expression of genes encoding T-cell and B-cell activation, proliferation and differentiation, as well as Toll-like receptors (TLRs), in the small intestinal tissues was assessed using a 96-well RT-PCR arrays. Results and Conclusions: Regarding the microbiota composition, independently of the analysis methods, our results showed, for the first time to our knowledge, that supplementation of infant formula with polyamines modulates Bacteroides-Prevotella, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. and Akkermansia-like bacteria groups, including A. muciniphila, to levels closely related to normal lactation group, in a dose-dependent manner and immune system parameters in infant formula feeding compared to mice with normal lactation. Similar to microbiota, the supplementation of manufactured infant formula in polyamines induces changes in lymphocyte populations and gene expression, increasing the percentage of B-cells in blood and CD4+, CD8+ and B-cells in the spleen in a dose-dependent manner, and it reduces differences in the expression of Cd1d1, Cd40, Hdac5, Hdac7, Clcf1 and Tlr4 genes compared with normal lactation. The results obtained from this study highlight the complex interplay between nutrition, the immune system and microbial colonization patterns during lactation. Such an effect requires further investigation in human infants because supplementation of an infant formula in polyamines might contribute to healthy gastrointestinal tract development in children fed with commercial formula.