Regulació de la regeneració anterior a través de la via egfr-3/egr-4 en la planària Schmidtea mediterranea

Abstract

Les planàries d'aigua dolça s’han convertit en un bon model per estudiar la regeneració a nivell genètic i molecular, gràcies a la seva capacitat de reconstruir qualsevol fragment danyat a conseqüència d’una amputació, des de qualsevol eix corporal i formar un nou organisme adult en un termini de temps molt curt. Al mateix temps, durant l’estadi adult en l’absència d’una ferida, les planàries són capaces de reemplaçar les cèl•lules diferenciades dels teixits vells mitjançant una proliferació i diferenciació constant de les cèl•lules mare o neoblasts.

Tenim al nostre abast un ampli coneixement sobre diverses rutes de senyalització que controlen l’estricte procés de la regeneració en les planàries. D’altra banda, avui dia encara es desconeix la funció d’algunes de les vies principals i queden molts elements desconeguts per entendre el fenomen de la regeneració. En aquesta tesi doctoral, hem pogut analitzar la funció concreta de la via dels EGFR, sobretot durant la formació del blastema i la regulació del creixement i la diferenciació de les noves estructures anteriors. Mitjançant estudis funcionals a través de la tècnica d’interferència de l’ARN (ARNi) dels tres EGFR identificats, hem observat la participació d’aquesta via en múltiples processos biològics durant la regeneració de les planàries i la homeòstasi. Smed-egfr-1 és necessari per a la regeneració de les cèl•lules pigmentàries dels ulls i la faringe. A més a més, el seu silenciament ocasiona una clara hiperproliferació i la formació d’uns bonys dorsals característics, tant en animals intactes com regenerants. D’altra banda, no es manifesta cap efecte evident després de silenciar Smed-egfr-2. Finalment, podem concloure que Smed-egfr-3 és necessari per la formació del blastema i per la diferenciació de determinats tipus cel•lulars, generalment neuronals.

En aquesta tesi ens hem centrat sobretot amb l’estudi del Smed-egfr-3. Amb l’objectiu d’identificar possibles gens diana d’aquest gen i caracteritzar la funció de la via dels EGFR en més detall durant la regeneració de les planàries, hem utilitzat l’eina DGE (“Digital Gene Expression”), que ens permet comparar el transcriptoma dels animals on s’ha silenciat un gen d’interès (en el nostre cas, Smed-egfr-3) amb el dels controls. Així, a partir d’anàlisis del DGE hem pogut conèixer i quantificar l’expressió de possibles gens diana regulats (tant “up” com “down-regulated”) per la via dels EGFR; un d’aquests gens “downregulated” després d’inhibir Smed-egfr-3 és l’egr-4, un membre de la família gènica dels “early growth response”.

egr-4 s’expressa majoritàriament en el sistema nerviós central i s’indueix ràpidament després de qualsevol tipus de ferida. El seu silenciament inhibeix la regeneració anterior, mostrant defectes durant la formació dels blastemes anteriors, però sense afectar la regeneració posterior. Aquests organismes tractats exhibeixen uns ganglis cefàlics més petits o fins I tot en alguns casos absents. La diferenciació d’altres tipus cel•lulars presents en la regió anterior també es mostren alterats després de silenciar egr-4. Tot i així, l’expressió primerenca dels determinants de la polaritat que intervenen en el restabliment de la polaritat anterior es mostren inalterats.

Experiments simultanis del silenciament d’egr-4 i elements de la via Wnt/beta-cat revelen que egr-4 és necessari per la diferenciació del primordi del cervell. A més a més, els resultats d’aquests experiments suggereixen que egr-4 promou la regeneració cefàlica inhibint l’activitat de beta-catenin en condicions normals. A partir dels resultats obtinguts en aquesta tesi suggerim que egr-4 és un dels primers gens coneguts necessaris per la diferenciació del primordi del cervell durant la regeneració de la planària.

En resum, suggerim una relació entre la diferenciació primerenca del cervell i la correcta progressió de la regeneració del cap en les planàries, que podria estar regulada gràcies a l’activació del gen egr-4 a través de la via EGFR, concretament Smed-egfr-3.

During freshwater planarians regeneration, polarity and patterning programs play essential roles in determining whether a head or a tail regenerates at anterior or posterior-facing wounds. This decision is made very soon after amputation. The pivotal role of the Wnt/beta-•catenin and Hh signaling pathways in re-establishing anterior4 posterior polarity has been well documented. However, the mechanisms that control the growth and differentiation of the blastema in accordance with its anteriorposterior identity are less well understood. Conserved signa ling pathways play important roles in morphogenesis in all animals. One such pathway is the epidermal growth factor receptor (EGFR) pathway, which regulates multiple biological processes including cell proliferation, differentiation, apoptosis and cell survival. In this thesis, we show that silencing of Smed-egfr4 3, a planarian homologue of epidermal growth factor receptors, impairs regeneration and blastema growth in these organisms, probably by disrupting cellular differentiation.

In order to better characterize the function of the EGFR signaling pathway during planarian regeneration, we conducted "Digital Gene Expression" analyses to identify putative target genes of Smed-egfr-3. One of the isolated candidate genes that is downregulated after silencing Smed-egfr-3 is egr-4, a member of the early growth response gene family. egr-4 is mainly expressed in the central nervous system and rapidly induced after different types of injury. While early egr-4 expression after injury is independent of EGFR signa ling, it becomes Smed-egfr4 34 dependent from the second day of regeneration.

Functional analyses based on RNA interference (RNAi) reveals that egr-4 is required for head regeneration but not for posterior regeneration; egr-4 silencing impairs the formation of anterior blastemas; these animals exhibit either small cephalic ganglia or a total absence of new brain tissue. Single and combinatorial RNAi to target different elements of the Wnt/beta-•catenin pathway, together with expression analysis of brain4 and anterior4 specific markers, reveal that egr-4 is necessary for the brain primordia differentiation in the early stages of regeneration and it appears to antagonize the activity of the Wnt/~-catenin pathway to allow head regeneration. Our results suggest that a conserved EGFRjegr pathway plays an important role in cell differentiation during planarian regeneration and indicate an association between early brain differentiation and the progression of head regeneration.