Bioanalytical applications of polyoxometalates using molecular tools for detection of DNA and SNPs in primer extension

Abstract

L'objectiu general de la present tesi és el desenvolupament d'una plataforma per la detecció electroquímica de mutacions genètiques emprant un mètode d'alta especificitat basat en l'extensió de seqüències d'ADN, anomenades cebadors, disposades organitzadament sobre una superfície (APEX). Per tant el treball inclou la preparació de molècules que constitueixen marcadors electroquímics i que van ser posteriorment enllaçades de manera covalent a les quatre bases d'ADN i, a més, el desenvolupament d'una plataforma robusta resistent a altes temperatures, que són necessàries durant la incorporació per la via enzimàtica de les bases d'ADN marcades. En la primera part del present treball, es van sintetitzar dues classes de polioxometalats (anomenats Keggin and Dawson POM) i van ser covalentment enllaçats a seqüències d'ADN. A més, al costat d'altres marcadors electroquímics, van ser enllaçats covalentment a bases d'ADN individuals per a la detecció de mutacions genètiques. A la segona part es va desenvolupar un nou mètode per a la funcionalització de superfícies de carbó vitri basat en processos electroquímics consecutius d'hidrogenació i cloració. Aquestes superfícies modificades van ser utilitzades per a la immobilització de molècules tioladas, incloent ADN tiolado. Finalment, les molècules sintetitzades i les superfícies modificades van ser usades per a la detecció electroquímica de mutacions genètiques seguint la metodologia APEX.

El objetivo general de la presente tesis es el desarrollo de una plataforma para la detección electroquímica de mutaciones genéticas empleando un método de alta especificidad basado en la extensión de secuencias de ADN, llamadas cebadores, dispuestas organizadamente sobre una superficie (APEX). Por tanto el trabajo incluye la preparación de moléculas que constituyen marcadores electroquímicos y que fueron posteriormente enlazadas de forma covalente a las cuatro bases de ADN y, además, el desarrollo de una plataforma robusta resistente a altas temperaturas, que son necesarias durante la incorporación por la via enzimática de las bases de ADN marcadas. En la primera parte del presente trabajo, se sintetizaron dos clases de polioxometalatos (llamados Keggin and Dawson POM) y fueron covalentemente enlazados a secuencias de ADN. Además, junto a otros marcadores electroquímicos, fueron enlazados covalentemente a bases de ADN individuales para la detección de mutaciones genéticas. En la segunda parte se desarrolló un nuevo método para la funcionalización de superficies de carbón vítreo basado en procesos electroquímicos consecutivos de hidrogenación y cloración. Estas superficies modificadas fueron utilizadas para la inmovilización de moléculas tioladas, incluyendo ADN tiolado. Finalmente, las moléculas sintetizadas y las superficies modificadas fueron usadas para la detección electroquímica de mutaciones genéticas siguiendo la metodología APEX.

This PhD work was started with the intention of developing platform for electrochemical detection of mutations using highly specific method called arrayed primer extension. So the work involves the preparation of labels to be linked with the four different DNA bases and the preparation of robust platform which can withstand the high temperature during enzymatic incorporation of the labelled DNA bases. The first part of this work deals of the preparation of compounds called polyoxometalates (Keggin and Dawson types) and their covalent attachment to DNA sequence and also, to DNA single bases along with other organic redox labels for mutation detection. In the second part while trying to achieve a thermally stable surface tethered DNA probes, a new method of surface functionalisation based on electrochemical hydrogenation followed by electrochemical chlorination of glassy carbon was developed. The so prepared surfaces were used for immobilisation of thiolated molecules including thiolated DNA. Finally the synthesised molecules and modified surfaces were used for electrochemical detection of genetic mutation following the APEX protocol.