Análisis genómico y proteómico de los mecanismos de captación de hierro en

Abstract

El objetivo central de la presente tesis doctoral fue la caracterización de los mecanismos de captación de hierro de <i>Aeromonas</i> mesófilas, así como de la contribución de dichos sistemas a la virulencia. <br/>Los bioensayos con las cepas indicadoras <i>A. hydrophila</i> SB22 (mutante <i>amoA</i>) y <i>E. coli</i> AN346 (mutante <i>entA</i>), nos permitieron identificar de forma presuntiva el sideróforo secretado por las diferentes cepas de <i>Aeromonas</i> spp.; generalmente amonabactina o enterobactina.<br/>El siguiente paso fue la obtención de un banco de mutantes por la inserción del elemento de transposición mini::Tn5-Km en un derivado rifampicina resistente de la cepa <i>A. hydrophila</i> AH-3. Los mutantes AH-768 y AH-777 mostraron un aumento notable de los niveles de producción de sideróforos, una disrupción de la capacidad de crecimiento en presencia de agente quelante y una discapacidad de utilización de la amonabactina y de la enterobactina como fuente de hierro. Estas alteraciones fueron relacionadas en el caso del mutante AH-768 con la carencia de una IROMP de 70 kDa de P.M. aparente y con un fenotipo atenuado en su virulencia. Los estudios de inmunodetección empleando antisuero específico contra la proteína FapA, nos permitieron detectar una IROMP en las cepas de <i>Aeromonas</i> productoras de amonabactina, y en algunas cepas de <i>Aeromonas </i>productoras de un sideróforo que no es amonabactina ni enterobactina. Pero en ningún caso se observó reacción alguna con las IROMP de las cepas de <i>Aeromonas</i> productoras de enterobactina. <br/><br/>La determinación del punto de inserción del transposón en el cromosoma de los mutantes AH-768 (<i>fapA</i>) y AH-777 (<i>fapG</i>), permitió obtener la secuencia nucleotídica de la agrupación génica relacionada con la captación de hierro de elevada afinidad en <i>A. hydrophila</i> AH-3. Dicha agrupación génica consta de quince genes entre los cuales se localizan genes que codifican para la biosíntesis del ácido dihidroxidobenzoico (genes <i>amlABC</i>), genes que codifican para una sintetasa de péptidos no ribosomales (genes <i>amlDEFGHB</i>), para un receptor de ferri-sideróforos de membrana externa (denominado <i>fapA</i>), para un sistema transportador ABC dependiente de proteína periplasmática (genes <i>fapBDGC</i>) y para un putativo componente del sistema de secreción de sideróforos (<i>gen mrp</i>). Se observó una relación entre la presencia de los genes <i>amlF, amlH</i> y <i>fapA</i> y el sistema de captación de hierro en cepas de <i>Aeromonas</i> mesófilas cuyo sideróforo había sido caracterizado como amonabactina mediante la técnica del bioensayo. <br/><br/>La predicción de la funcionalidad de la SPNR codificada por la agrupación génica de sideróforos de la cepa <i>A. hydrophila</i> AH-3 a partir de su composición en dominios catalíticos, concordó con las actividades catalíticas necesarias para la formación de amonabactina. A destacar, la presencia de un dominio de epimerización y la presencia de dominios de adenilación específicos para la activación de L-Lisina, L-aminoácido aromático (L-triptófano o L-fenilalanina) y L-glicina.<br/>La obtención de un mutante con alteraciones en la ruta de biosíntesis de sideróforos previas a la formación del 2,3-DHBA, nos permitió afirmar que la cepa AH-3 secreta únicamente sideróforos de tipo catecolato y que dicha cepa utiliza la amonabactina como fuente de hierro de forma mucho más eficiente que la enterobactina. A su vez, el mutante no productor de sideróforos mostró un fenotipo atenuado en su virulencia. La obtención y caracterización fenotípica de mutantes por recombinación en un punto de los diferentes componentes del sistema de transporte de sideróforos (<i>fapA, fapB, fapG, fapC</i>) nos permitió afirmar que el receptor de ferri-sideróforos de membrana externa y el sistema transportador ABC dependiente de proteína periplasmática intervienen en la captación del hierro de la ferri-amonabactina y de la ferri-enterobactina. Se demostró también la independencia entre el sistema de captación de hierro de elevada afinidad y el sistema de captación del hierro de los compuestos que contienen grupo hemo.<br/>Clonamos el receptor de hemo de la cepa <i>A. hydrophila</i> AH-3 mediante complementación interespecífica de un mutante de <i>E. coli hemA aroB,</i> cuya membrana externa es impermeable al hemo. La reconstitución en <i>E. coli</i> del sistema de utilización del grupo hemo y de la hemoglobina como fuente de hierro y como fuente de porfirina, mediada por el gen <i>ahuR</i> y su entorno en el genoma, es un proceso TonB dependiente. La presencia de AhuR en la cepa AH-3 se mostró imprescindible para la utilización del hierro de diferentes compuestos que presentan grupo hemo. El gen <i>ahuR</i> está ampliamente distribuido entre las diferentes cepas de <i>Aeromonas</i> mesófilas, a pesar del elevado grado de heterogeneidad de las secuencias nucleotídicas de dichos microorganismos.