Anàlisi molecular i funcional de la presenilina de

Abstract

Mutacions en els gens de les presenilines 1 i 2 són causants d'un 50% dels casos d'un determinat tipus de malaltia d'Alzheimer, conegut com a Alzheimer presenil, d'herència autosòmica dominant. En aquesta tesi doctoral, s'ha utilitzat l'homòleg de les presenilines a <i>Drosophila melanogaster</i> per realitzar una aproximació a la funció d'aquesta proteïna.<br/>Es coneix que la presenilina es sintetitza en el reticle endoplasmàtic com a precursor, amb 8 dominis transmembrana. Aquesta proteïna, experimenta un tall proteolític, anomenat presenilinasa, que genera dos fragments: un fragment aminoterminal o NTF i un fragment carboxiterminal o CTF, que són la forma de presenilina majoritària, estable i funcional. <br/>En aquest treball, s'ha pogut determinar que els fragments NTF i CTF formen homodímers amb ells mateixos i un heterodímer NTF:CTF. D'aquest resultat, es pot concloure que la presenilina és un tetràmer, amb dos fragments NTF i dos fragments CTF. S'ha provat d'acotar les regions dins de cada fragment implicades en aquestes interaccions i s'ha observat que una regió hidrofílica encarada cap a la llum del reticle endoplasmàtic que connecta les regions transmembrana I i II (HL1), és capaç d'homodimeritzar i, per tant, participa en l'homodímer NTF:NTF. A més, en aquesta regió altament conservada en l'escala evolutiva, es concentren un elevat nombre de mutacions causants d'Alzheimer. Es van introduir en l'HL1, mitjançant mutagènesi dirigida algues de les mutacions, i es va observar que totes elles alteren de forma significativa, tant per increment com per decrement, la interacció entre dos HL1. <br/>Per tal d'aprofundir en l'estructura d'aquest tetràmer, es van realitzar una sèrie de delecions de diferents regions de la presenilina, mitjançant les quals es va poder observar que totes les regions transmembrana participen en la formació de l'homodímer NTF:NTF i de l'homodímer CTF:CTF. La substitució de l'HL1 dins del fragment NTF per una altra regió hidrofílica de longitud molt inferior produeix, en l'homodímer NTF:NTF, un increment de la interacció. D'aquestes dades s'hipotetitza que aquesta regió hidrofílica tindria el rol de regular la interacció entre els dos fragments NTF o de determinar la col·locació de les regions transmembrana i, en definitiva, del tetràmer. <br/>Les darreres dades de la literatura indiquen que la presenilina forma part d'un complex proteic que contindria l'activitat gamma-secretasa, responsable de produir, entre d'altres, el pèptid beta-amiloide el qual forma dipòsits insolubles característics de la malaltia d'Alzheimer a partir de la seva proteïna precursora, i d'alliberar el domini intracel·lular del receptor Notch. S'ha hipotetitzat que la presenilina és la pròpia gamma-secretasa que s'autoactivaria pel tall presenilinasa, i que dos residus aspàrtics situats a les regions transmembrana VI i VII formarien un grup di-aspartil catalític. <br/>Es van realitzar experiments en cèl·lules en cultiu de <i>Drosophila melanogaster</i>, en les quals es va sobreexpressar de forma transitòria diferents variants mutades de la presenilina. D'una banda, es va observar que la presenilina és sensible a la introducció de seqüències extres, que codifiquen per epítops que en permeten la immunodetecció, en els dos extrems, amino i carboxiterminal. De l'altra banda, es va poder corroborar que la substitució d'un dels residus aspàrtic catalític inhibeix el tall proteolític de la presenilina. La substitució de l'HL1 també produeix una inhibició de l'endoproteòlisi. <br/>Les dades de la literatura postulen que la presenilina s'autoactiva per endoproteòlisi. Les dades generades en aquest treball indiquen que la presenilina és un tetràmer, i obren la possibilitat que el tall productor dels fragments NTF i CTF es pugui produir de forma intramolecular i/o intermolecular, entre dues presenilines. Es va explorar aquesta possibilitat mitjançant la coexpressió transitòria de dues variants de presenilina en cèl·lules SL2, i es va obtenir un resultat molt preliminar indicatiu que el tall es produiria intermolecularment.