Fisiología del envejecimiento en peces teleósteos del género Nothobranchius= Physiology of ageing in teleost fish of the genus Nothobranchius

Abstract

El objetivo de esta Tesis Doctoral, titulada “Fisiología del envejecimiento en peces teleósteos del género Nothobranchius” es caracterizar el envejecimiento de dos especies del género Nothobranchius (N. korthausae y N. rachovii), considerando aspectos hasta ahora no estudiados en este género: las variaciones relacionadas con el envejecimiento en la composición de las membranas lipídicas mitocondriales, concretamente de las distintas especies fosfolipídicas y los ácidos grasos que las integran, y los cambios en el sistema circadiano (CS) con la edad, considerando el ritmo de actividad locomotora como marcador de su funcionamiento. En primer lugar, se estableció una colonia permanente de estas especies en el Laboratorio de Cronobiología de la Universidad de Murcia. De este modo, se pudo disponer de individuos de cada una de las etapas del ciclo vital. Con el objetivo de determinar las variaciones relacionadas con el envejecimiento en la composición de las membranas lipídicas mitocondriales, se procedió en primer lugar a la separación de las mitocondrias del resto de componentes celulares en muestras de individuos de diferentes edades, usando para ello centrifugaciones seriadas en un gradiente de sacarosa, para después proceder a la extracción del lípido total de acuerdo con el método de Folch. A partir del lípido total mitocondrial, se separaron y cuantificaron las distintas fracciones fosfolipídicas mediante cromatografía de capa fina y se obtuvieron los perfiles de ácidos grasos de cada una de ellas mediante transmetilación catalizada por ácido y cromatografía gas-líquido. El funcionamiento del CS de los peces se midió a través del estudio del ritmo de actividad locomotora. Para ello, se situaron individuos de diferentes edades en cámaras específicamente diseñadas. Estas cámaras estaban dotadas de fotocélulas que registraban constantemente la actividad de los peces y enviaban la información a una placa de registro en un sistema informático. De este modo, se obtenían series temporales de datos que eran analizadas mediante un software específico para ritmos circadianos así como métodos analíticos desarrollados para esta Tesis Doctoral. Las dos especies de Nothobranchius estudiadas mostraron cambios morfológicos fácilmente identificables a simple vista, como una pérdida patente de coloración, pérdida de peso y curvatura de la espina dorsal. A nivel bioquímico, los peces mostraron membranas mitocondriales altamente insaturadas, lo cual está relacionado con una alta tasa metabólica y alto estrés oxidativo y es característico de especies que, como las dos estudiadas, presentan fases de crecimiento explosivo. Unas membranas mitocondriales altamente insaturadas están también relacionadas con un ciclo vital corto, debido a la alta tasa de oxidación de las moléculas mitocondriales, principalmente los lípidos de membrana, que desemboca en disfunción y apoptosis. Las membranas mitocondriales podrían ser los marcapasos de toda una serie de procesos que llevan al deterioro progresivo e irreversible que caracteriza al envejecimiento. Estos procesos afectarían a la funcionalidad de los sistemas fisiológicos del animal y aumentaría la fragilidad del individuo, que se mostraría incapaz de responder a estreses inesperados del ambiente. Los resultados del presente trabajo ponen de manifiesto que el CS de Nothobranchius es severamente afectado con la edad y su deterioro podría ser uno de los factores desencadenantes de las últimas etapas del proceso de envejecimiento. Esta Tesis Doctoral pone de manifiesto la idoneidad de la utilización de especies del género Nothobranchius como modelos para estudios de envejecimiento dadas sus características como un reducido ciclo vital, el bajo costo para su cría y mantenimiento en el laboratorio y por presentar un envejecimiento gradual fácil de caracterizar y extrapolable a humanos. Estas especies se han mostrado además útiles para testar el uso de agentes cronobióticos como la melatonina, abriendo todo un abanico de posibilidades para estudiar en el futuro cercano posibles tratamientos frente al envejecimiento.

The purpose of this Doctoral Thesis, entitled “Physiology of ageing in teleost fish of the genus Nothobranchius”, is to characterise the ageing process of two different species of the genus Nothobranchius (N. korthausae and N. rachovii) considering novel aspects never studied before in this genus: age-related variations in the mitochondrial lipid membrane composition, particularly in the different phospholipid classes and fatty acids which compose them, and the age-related changes in the circadian system, using the locomotor activity rhythm as a circadian system status indicator. Firstly, a permanent colony of these species was established in the Chronobiology Laboratory of the University of Murcia. Thereby it was possible to have individuals of each stage of the life cycle. In order to determine the age-related variations in the mitochondrial lipid membrane composition, the first step was to separate the mitochondria from other cellular components in samples obtained from fish of different ages, using serial centrifugations in a sucrose gradient. And the second step was proceeding with the total lipid extraction according to the Folch method. The different phospholipidic fractions were separated from the mitochondrial total lipid and quantified by thin-layer chromatography, and the fatty acid profile was obtained of each one by acid-catalysed transmethylation and gas-liquid chromatography. Fish CS functioning was measured by the study of locomotor activity rhythm. For that, individuals of different ages were placed in specifically designed chambers. These chambers were equipped by photoelectric cells which constantly register the fish activity and send the information to an informatics system. Temporal series data were obtained and analysed by a specific software for circadian rhythms as well as by analytic methods developed for this Doctoral Thesis. The two Nothobranchius species studied showed easily recognizable morphological changes, as colouration and body mass loss and spine curvature with age. At a biochemical level, fish showed highly unsaturated mitochondrial membranes, which is associated with high metabolic rate and oxidative stress, being characteristic of species that show explosive growth stages, like both species used. Highly unsaturated mitochondrial membranes are also related to a short lifespan, due to the high oxidation rate of mitochondrial molecules, mainly membrane lipids, which results in dysfunction and apoptosis. The mitochondrial membranes could be the pacemaker of a number of processes leading to a progressive and irreversible impairment which characterise the aging process. These processes affect animal physiological systems functionality and increase the individual fragility, showing the individual unable to respond to unexpected environmental stresses. Results from the present work show that Nothobranchius CS is strongly affected by age and its impairment could be one of the trigger factors of the last stages in the ageing process. This Doctoral Thesis shows the suitability of using Nothobranchius species as ageing models because of their characteristics as short lifespan, low-cost breeding and maintenance in the laboratory and by showing a progressive ageing easy to characterise and to extrapolate to humans. Also, these species have shown their potential to test the use of chronobiotic agents as melatonin, bringing us new possibilities to study, in the near future, possible treatments against ageing.