Effects of grape seed procyanidin extract on proliferation and apoptosis in pancreatic cells

Author

Cedó Giné, Lídia

Director

Pinent Armengol, Montserrat

Date of defense

2013-01-25

Legal Deposit

T 545-2014

Pages

266 p.



Department/Institute

Universitat Rovira i Virgili. Departament de Bioquímica i Biotecnologia

Abstract

Procyanidins have been reported to modulate glucose homeostasis and β-cell functionality. However, their effects on pancreatic cell mass remain unknown. Therefore, this doctoral thesis focused on the study of the effects of a grape seed procyanidin extract (GSPE) on proliferation and apoptosis processes in pancreatic cells. Our results indicate that although the extract did not affect these processes under healthy conditions, it modulated β-cell proliferation and apoptosis under altered conditions. In vitro, GSPE enhanced the pro-apoptotic effects of high glucose and were antiproliferative under high glucose, insulin, and palmitate levels in the INS-1E cell line. In vivo, the effects of the extract depended on the dose, the duration of the treatment, and/or the gender. However, the extract tended to counteract the deleterious effects of the cafeteria diet or the Zucker Fatty genotype. Concerning the adenocarcinoma cell line MIA PaCa-2, GSPE exerted antiproliferative and pro-apoptotic effects, demonstrating anti-carcinogenic activity.


Les procianidines són compostos fenòlics abundants en plantes i vegetals. S’ha demostrat que aquests compostos bioactius tenen efectes beneficiosos per la salut, entre els quals destaquen les seves propietats antiinflamatòries i antioxidants. També s’ha vist que participen en l’homeòstasi dels lípids i la glucosa. En un estudi previ realitzat en el grup de recerca, es van avaluar els efectes d’un extracte de procianidines de pinyol de raïm (GSPE) en un model de resistència a la insulina induït per l’alimentació de rates femelles amb una dieta de cafeteria. Es va veure que el GSPE reduïa l’índex HOMA-IR i els nivells d’insulina plasmàtica, suggerint una millora de la resistència a la insulina en teixits perifèrics. A més a més, aquests resultats semblaven indicar que les procianidines podrien estar afectant el pàncrees, el principal òrgan responsable de l’homeòstasi dels nutrients, ja sigui millorant la funcionalitat o la massa de les cèl•lules β pancreàtiques. De fet, en una tesi doctoral duta a terme en paral•lel amb una altra, en la qual es va concloure que les procianidines actuen en el pàncrees modulant la síntesi, secreció i degradació de la insulina. Els individus amb diabetis del tipus 2 presenten hiperglucèmia i un metabolisme lipídic alterat, juntament amb resistència a la insulina, disfunció de les cèl•lules β i disminució de la massa β. Tot i que determinats factors genètics hi estan implicats, la diabetis del tipus 2 està estretament lligada a l’obesitat, i ambdós patologies estan assolint proporcions d’epidèmia a nivell mundial. En els primers estadis de la resistència a la insulina, la massa β s’incrementa per compensar la hiperglucèmia. Tot i així, quan les cèl•lules β ja no són capaces de compensar l’augment de la demanda d’insulina, la massa β es veu reduïda degut a un augment de l’apoptosi. A més a més, considerant el pàncrees, l’adenocarcinoma pancreàtic és un dels càncers més agressius, caracteritzat per una elevada resistència al tractament. L’acumulació d’alteracions genètiques resulta en un augment del creixement cel•lular i de la proliferació i en una inhibició de l’apoptosi. D’aquesta manera, l’obtenció d’informació sobre els compostos naturals amb efectes beneficiosos sobre la proliferació i l’apoptosi en les cèl•lules pancreàtiques, processos estretament lligats i alterats en les malalties mencionades anteriorment, és de gran interès. Els efectes de les procianidines sobre la proliferació i l’apoptosi han estat molt estudiats en diferents tipus cel•lulars. En línies cel•lulars de càncer les procianidines baixen els nivells de proliferació i incrementen l’apoptosi, actuant com a anticarcinogèniques. En altres tipus cel•lulars, les procianidines actuen com a eina terapèutica, protegint les cèl•lules del dany induït per factors ambientals o químics, disminuint l’apoptosi i estimulant el creixement cel•lular. Tot i així, existeix poca informació relativa als efectes de les procianidines en el pàncrees. Per tant, aquesta tesi doctoral es va centrar en l’estudi dels efectes de les procianidines sobre la proliferació i l’apoptosi de les cèl•lules pancreàtiques, avaluant la modulació d’aquests processos en situacions fisiològiques o patològiques. Per assolir els nostres objectius, vam utilitzar models in vivo de rates sanes, de rates amb obesitat induïda per la dieta i rates amb obesitat induïda genèticament; i models in vitro, usant la línia cel•lular d’insulinoma de rata INS-1E i d’adenocarcinoma de pàncrees MIA PaCa-2. La hiperglucèmia postprandial i la dislipèmia són factors comuns que tenen lloc prèviament al desenvolupament de la diabetis del tipus 2. L’exposició crònica a un ambient hiperglucèmic i a elevades concentracions d’àcids grassos causa la disfunció de les cèl•lules β pancreàtiques i la mort cel•lular, fenòmens anomenats glucotoxicitat i lipotoxicitat, respectivament. D’aquesta manera, quan vam exposar les cèl•lules INS-1E a elevades concentracions de glucosa i palmitat, ambdós nutrients van incrementar l’apoptosi. Quan, en aquestes condicions, les cèl•lules es van tractar amb GSPE, l’extracte va incrementar els efectes pro-apoptòtics de l’elevada glucosa, sense modificar la situació de lipotoxicitat. L’apoptosi induïda pel GSPE en situacions d’hiperglucèmia involucra la via intrínseca de l’apoptosi. In vivo, vam continuar l’estudi previ realitzat en rates femelles amb obesitat induïda per una dieta de cafeteria realitzat, i vam veure que GSPE modulava els marcadors d’apoptosi en el pàncrees d’aquestes rates, però els efectes eren dependents de la dosi i el període de tractament. Tot i així, el tractament semblava que tendia a contrarestar l’augment de l’apoptosi de les rates alimentades amb dieta de cafeteria. En canvi, quan els efectes de l’extracte es van analitzar en rates mascle, GSPE incrementava un marcador pro-apoptòtic, suggerint un increment de l’apoptosi en les rates tractades amb l’extracte. D’aquesta manera, es conclou que la modulació dels marcadors d’apoptosi per part del GSPE en rates alimentades amb dieta de cafeteria és dependent de la dosi, el període de tractament i/o el gènere. Pel que fa als efectes de GSPE sobre la proliferació, quan les cèl•lules β pancreàtiques es van exposar a elevats nivells de glucosa i insulina, els quals indueixen la proliferació, i nivells alts de palmitat, el qual inhibeix la proliferació, l’extracte va mostrar un clar efecte antiproliferatiu. Aquests efectes antiproliferatius són probablement a causa de les molècules d’alt pes molecular, les quals no es poden absorbir a l’intestí, de manera que cal tenir-ho en compte en el moment de comparar els efectes obtinguts in vitro amb els possibles efectes in vivo. De fet, en els experiments de rates alimentades amb una dieta de cafeteria, el GSPE no va modificar els marcadors de proliferació analitzats. Com a model d’obesitat induïda genèticament, es van utilitzar rates Zucker Fatty. Quan aquestes rates es van tractar crònicament amb GSPE, tot i que l’extracte contrarestava l’expressió de marcadors d’apoptosi i proliferació en comparació amb les rates obeses no tractades, els canvis moleculars induïts per les procianidines no van ser suficients per contrarestar l’efecte genètic de les rates Zucker Fatty a un nivell fisiològic, ja que tant l’apoptosi com els nivells plasmàtics de glucosa i insulina eren tan elevats com en les rates control. En aquest experiment, també es va analitzar el perfil proteic dels illots realitzant un estudi de proteòmica. Un dels processos biològics en els quals les proteïnes modificades per GSPE estaven involucrades era l’apoptosi i la mort cel•lular. Els nivells de la majoria de les proteïnes incloses en aquest grup contrarestaven els efectes del genotip Zucker Fatty, de la mateixa manera que es va observar en els marcadors d’expressió gènica. Per tant, tenint en compte les rates Zucker Fatty com a referència d’apoptosi, el GSPE tendia a millorar aquest procés, tot i que no va induir canvis als nivells finals d’apoptosi. Un cop analitzats els efectes de GSPE en les cèl•lules β en situacions patològiques, es van avaluar els seus efectes en situacions fisiològiques. El tractament de les cèl•lules INS-1E amb GSPE no va modificar ni l’apoptosi ni la proliferació d’aquestes cèl•lules. Aquests resultats in vitro coincideixen amb els observats in vivo, en els quals, el tractament crònic de rates amb GSPE no va modificar ni l’apoptosi ni la massa β. En aquest experiment, el perfil de microRNA també es va analitzar, ja que alguns microRNA s’ha vist que poden regular la funció pancreàtica, incloent la regulació de la síntesi i la secreció de la insulina i l’apoptosi. Tot i que vam trobar que els microRNAs dels illots pancreàtics eren diana de les procianidines, els modificats per l’extracte no estan involucrats en els processos de proliferació i apoptosi, fet que confirma el fet que el GSPE no altera aquests processos en condicions fisiològiques. Finalment, una altra situació patològica en la qual la proliferació i l’apoptosi estan alterats en cèl•lules pancreàtiques és en càncer, en el qual la proliferació està incrementada i l’apoptosi inhibida. D’aquesta menera, vam analitzar els efectes del GSPE en la línia cel•lular d’adenocarcinoma pancreàtic MIA PaCa-2 i vam veure que l’extracte inhibia la proliferació cel•lular i incrementava l’apoptosi, procés mediat per la modulació de proteïnes de la família de la Bcl-2 i per la despolarització de la membrana mitocondrial, implicant la via intrínseca de l’apoptosi. En aquest cas, els components de l’extracte amb més activitat antiproliferativa i pro-apoptòtica també van ser identificats. Tant l’epigal•locatequina gal•lat com l’àcid gàl•lic foren els components amb efectes antiproliferatius més elevats, però, considerant que la concentració d’àcid gàl•lic en l’extracte és més de 40 vegades més elevat que la d’epigal•logatequina gal•lat, es va considerar l’àcid fenòlic com un dels components de l’extracte responsables dels efectes observats. De la mateixa manera que el GSPE, l’àcid gàl•lic modulava l’expressió de proteïnes de la família de la Bcl-2 i promovia la despolarització de la membrana mitocondrial. En aquest estudi, es van utilitzar dues aproximacions per tal d’apropar-nos a una situació in vivo, ja que un cop ingerides, no tots els components de les procianidines són absorbides a l’intestí. Prèviament, són hidrolitzades en l’intestí prim i metabolitzades en l’intestí prim i el fetge. A més a més, les procianidines i els metabòlits que no són absorbits en l’intestí prim, poden ser absorbits en l’intestí gros posteriorment a l’acció de la microflora bacteriana. D’aquesta manera, per una banda, vam tractar les cèl•lules amb medis basolaterals que contenien els components de l’extracte absorbits i metabolitzats pels enteròcits humans Caco-2. Aquest sistema és novedós, tot i així, les cèl•lules Caco-2 s’han usat àmpliament per estudiar l’absorció i secreció intestinal de fàrmacs i compostos de la dieta. Tot i així, els compostos absorbits i metabolitzats per les cèl•lules Caco-2 no van modificar la taxa de proliferació de les cèl•lules MIA PaCa-2. De fet, l’anàlisi dels medis basolaterals va revelar que ni l’epigal•locatequina gal•lat ni l’àcid gàl•lic, les molècules més efectives en la inhibició de la proliferació, no eren absorbits per les cèl•lules Caco-2. Per altra banda, també vam tractar les cèl•lules MIA PaCa-2 amb sèrums de rata tractats amb GSPE. Aquesta aproximació, que segons el nostre coneixement no s’havia usat anteriorment, permet l’exposició de les cèl•lules als compostos fenòlics absorbits i metabolitzats en l’organisme i que aconsegueixen arribar al teixit diana in vivo. Tot i que lleument, el tractament amb els sèrum de les rates tractades amb GSPE van inhibir la proliferació de les cèl•lules d’adenocarcinoma de pàncrees. Per concloure, en aquesta tesi doctoral hem vist que el GSPE modula la proliferació i l’apoptosi de les cèl•lules pancreàtiques, tant in vitro com in vivo, però els seus efectes són dependents del model, la dosi i la durada del tractament. Hem utilitzat tècniques òmiques i diferents aproximacions in vitro per tal d’acostar-nos a situacions in vivo, a més d’identificar les molècules de l’extracte responsables dels efectes observats.

Keywords

Procyanidins; Pancreatic cells; Apoptosis; Proliferation

Subjects

577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics; 663/664 - Food and nutrition. Enology. Oils. Fat

Documents

TESI LÍDIA CEDÓ.pdf

10.55Mb

 

Rights

ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.

This item appears in the following Collection(s)