Estudi de l'expressió i funció de les Ribonucleotidil Reductases d'Escherichia coli

Abstract

La Ribonucleotidil Reductasa (RNR) és un enzim essencial encarregat de reduir els ribonucleòtids (NTP) als seus corresponents deoxiribonucleòtids (dNTP) per a la síntesi i reparació de l’ADN, és per això que requereix de ser finament regulat per mantenir els correctes nivells de dNTP cel•lulars. A diferència dels organismes eucariotes, els quals només codifiquen per una classe d’aquest enzim en el seu genoma (la classe Ia), els organismes procariotes poden codificar tres classes diferents de l’enzim (classe I, II i III) i diferents combinacions d’elles en el cromosoma. Les diferents classes de RNR s’expressen a diferents condicions ambientals, incrementant així la seva adaptació ambiental.

El microorganisme Escherichia coli codifica en el seu genoma per la RNR de classe I (subdividida en classe Ia i Ib), la qual és activa en condicions aeròbiques, i classe III, només activa en condicions d’anaerobiosi. El principal objectiu d’aquesta tesi titulada “Estudi de l’expressió i funció de les Ribonucleotidil Reductases d’Escherichia coli” ha estat estudiar l’expressió diferencial i la funció de les RNR d’aquest bacteri en diferents condicions ambientals així com, intentar saber més sobre la seva regulació transcripcional. S’ha estudiat l’efecte del regulador global de transcripció gènica H-NS en la transcripció de les tres classes de RNR presents en E. coli i s’ha delimitat la regió d’unió del transcripcional en la regió promotora de la RNR de classe Ia. A més a més, s’ha volgut estudiar diferents efectes ambientals com l’osmolaritat, la temperatura i la disponibilitat d’oxigen en la regulació d’H-NS sobre les diferents classes de RNR. També s’ha pretés analitzar l’expressió diferencial de les diferents classes de RNR durant un procés de formació de biofilm i els mecanismes que fan canviar l’expressió de les RNR durant la maduració d’aquest complex bacterià. L’estudi s’ha dut a terme en una soca no patògena d’E. coli (la soca MG1655) però també en una soca enteropatogènica (la soca E2348/69) per intentar observar diferències o semblances en el patró d’expressió de les diferents classes de RNR durant la formació de biofilm. Seguidament, el fet que els organismes procariòtics expressin més d’una classe de RNR va fer que es volgués investigar una possible funció en la virulència bacteriana d’alguna de les diferents classes de RNR. En aquesta línia d’investigació s’ha estudiat l’expressió diferencial de les RNR durant un procés infectiu utilitzant la soca adhesiva i invasiva d’E. coli (AIEC) LF82, principal soca colonitzadora de malalts de Crohn i que te la capacitat de replicar dins del macròfag. Finalment, en aquesta tesi també s’ha inclós un estudi transcriptòmic global del factor transcripcional NrdR, inicialment descrit com a repressor de les diferents classes de RNR, amb l’objectiu de trobar més gens pertanyents al seu reguló i intentar trobar similituds en el seu mecanisme de regulació transcripcional gènica.

Ribonucleotide Reductase (RNR) is an essential enzyme responsible to provide the required dNTP for the DNA synthesis and repair. Surprisingly, eukaryotic organisms only encode for one class of the enzyme in their genome whereas in the prokaryotic world we can find three different classes of the enzyme (class I, II and III) and also different combinations of them encoded in the genome. The different classes of RNR are expressed in different environmental conditions and require to be tightly regulated to maintain the cellular dNTP pools.

Escherichia coli encodes in its genome for the class I (subdivided in class Ia and Ib) and class III RNR. The global aim of this thesis has been to study the transcriptional regulation and the differential expression and function in different environmental conditions of the E. coli RNR classes. It has been provided the effect of the histone-like protein H-NS on the E. coli class Ia and III RNR transcription, the differential expression of the RNR classes during the biofilm formation of a non-pathogenic E. coli (MG1655 strain) and of an enteropathogenic E. coli (E2348/69 strain), the differential expression different RNR classes of the adherent and invasive E. coli (AIEC) LF82 during the infection and a global transcriptomic analysis of the NrdR transcriptional factor, only known for its repressive role on the transcription of RNR.